白驳丸质量标准提升研究

陈占功 赵小伟 吴剑坤 白 燕

首都医科大学附属北京中医医院药学部，北京 100010

白驳丸是北京市医疗机构法定制剂[1]，也是首都医科大学附属北京中医医院（以下简称“我院”）皮肤科常用的院内制剂（京药制字Z20063335），其治疗白癜风效果确切[2]。白驳丸处方主要包含炒蒺藜、防风、首乌藤、鸡血藤、当归、红花、赤芍、盐补骨脂、黑豆、陈皮10 味药，功效为补肾活血、散风通络，用于血瘀肾虚，风邪束表证，症见头晕、心悸、腰酸、畏寒，女性月经量少，皮肤色素脱失或色素减退，舌质淡，苔薄白，脉沉细、弦紧；白癜风见上述证候者。原制剂质量标准只有2 项试管反应，专属性差，无法控制白驳丸的质量。我院作为白驳丸的使用单位，笔者研究起草了白驳丸的质量标准，定性鉴别增加了蒺藜、防风、鸡血藤、红花、黑豆的显微鉴别和当归、首乌藤、赤芍的薄层色谱鉴别，鉴别药味占处方药味的80%；同时定量分析了异补骨脂素、补骨脂素的含量，以期全面反映和控制白驳丸的质量，保障临床疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 高效液相色谱仪（美国Agilent），DM2500 显微镜（德国Leica），十万分之一XS205 超越系列专业型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），YOKO-ZS紫外线分析摄影仪（武汉药科新技术开发公司），SK7210HP 型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照药材：当归（120927-200613）、首乌藤（120939-200705）、陈皮（969-9302）来源于中国食品药品检定研究院；对照品：芍药苷（110736-200934）、异补骨脂素（110738-20313）、补骨脂素（110739-201617）来源于中国食品药品检定研究院；硅胶G 板（青岛海洋化工厂）；甲醇（20200201）、乙醚（20180621）、乙酸乙酯（20191201）、正己烷（20190527）、氯仿（20170616）、甲酸（F1914077）、香草醛（20060522）、浓硫酸（20180524）、乙醇（20200211），所用试剂均为分析纯；实验用药材饮片由我院中药房提供；白驳丸（1904073、1912022、2002026）来源于我院。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

分别取白驳丸（1912022）适量，研磨成细粉，取少量透化后置10×40 倍显微镜下观察。

2.1.1 鸡血藤 鸡血藤的显微特征有棕红色色块，石细胞及纤维束和草酸钙方晶等。周围薄壁细胞中含草酸钙方晶，草酸钙方晶呈类双锥形或不规则形，形成晶纤维[3-4]，本研究以晶纤维为其鉴别特征。见图1。

图1 晶纤维

2.1.2 炒蒺藜 炒蒺藜为果实种子类药材，其木化的内果皮纤维特征较为独特。内果皮纤维木化，上下层纵横交错排列，作为蒺藜的鉴别特征[3-4]。见图2。

图2 内果皮纤维

2.1.3 红花 红花为本方中唯一的花类药材，以花粉粒作为其鉴别特征。花粉粒具3 个萌发孔，外壁有齿状突起，类圆形、椭圆形或橄榄形，直径60 μm 左右[3-4]。见图3。

图3 花粉粒

2.1.4 黑豆 黑豆的显微特征是具有种皮珊状细胞、种皮支持细胞、子叶细胞、草酸钙结晶等。其中，种皮珊状细胞紫红色，侧面观细胞1 列，长50～80 μm，壁厚，具光辉带且较为显著，本研究将种皮珊状细胞作为其鉴别特征[3-4]。见图4。

图4 种皮珊状细胞

2.1.5 防风 防风的显微鉴别特征为具有油管、叶基维管束、网纹导管、石细胞等。其中，油管直径17～60 μm，充满金黄色分泌物[3-4]，本研究以其作为防风的鉴别特征。见图5。

图5 油管

2.2 薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）鉴别

2.2.1 当归TLC 鉴别 取白驳丸（1912022）12 g，粉碎成细粉，加甲醇30 ml 后超声提取40 min，过滤，得到的滤液挥尽溶剂，剩余残渣水溶解后乙醚萃取2 次，合并乙醚层，挥尽溶剂，剩余残渣加乙酸乙酯1 ml 溶解，作为白驳丸供试液。取当归对照药材1 g，按以上供试液制备方法制成对照药材溶液。另外，按白驳丸处方配比，取除去当归的其他药材饮片，按白驳丸制法及供试液制法制成当归阴性对照液。依照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0502[5]收载的TLC进行试验，白驳丸供试液吸取10 μl，当归对照药材溶液吸取3 μl，当归阴性对照溶液吸取5 μl，分别点于同一块硅胶G 板上，采用正己烷-乙酸乙酯（4∶1）的展开剂展开，取出后晾干，置于365 nm 的紫外光灯下检视，结果可见，在供试品色谱中，与当归对照药材色谱相应位置处可见相同颜色的荧光斑点，当归阴性对照则没有干扰[4-6]。见图6。

图6 当归薄层色谱图

2.2.2 首乌藤TLC 鉴别 取首乌藤对照药材1 g，同“2.2.1”项下供试液制法制备对照药材溶液。另按白驳丸处方，取除去首乌藤的其他药材饮片，按白驳丸制法及供试液制法制成首乌藤阴性对照液。按照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0502[5]收载的TLC 进行试验，吸取“2.2.1”项下白驳丸供试液5 μl、首乌藤对照药材溶液3 μl、首乌藤阴性对照液5 μl，分别点于同一块硅胶G 板上，采用正己烷-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸（5∶5∶2∶0.1）展开，取出后晾干。置于365 nm 的紫外光灯下检视，结果可见，在供试品色谱中，与首乌藤对照药材色谱相应位置处有相同颜色的荧光斑点，首乌藤阴性对照则没有干扰[4-8]。见图7。

图7 首乌藤薄层色谱图

2.2.3 赤芍TLC 鉴别 将“2.2.1”中乙醚提取过的水层挥尽乙醚后，采用醋酸乙酯振摇萃取2 次，合并上层的醋酸乙酯层，挥尽醋酸乙酯，残渣用甲醇1 ml 溶解作为供试液。取芍药苷对照品用甲醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液。另按白驳丸处方，取除去赤芍的其他药材饮片，按白驳丸制法及供试液制法制成赤芍阴性对照液。依照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0502[5]收载的TLC 进行试验，吸取白驳丸供试液5 μl、芍药苷对照品溶液3 μl、赤芍阴性对照液5 μl，分别点于同一块硅胶G 板上，采用三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）展开，取出后晾干，喷以5%香草醛浓硫酸的乙醇溶液，加热至出现清晰斑点，于日光下检视，结果可见，在供试品色谱中，与芍药苷色谱相应位置处有相同颜色的斑点，赤芍阴性对照则没有干扰[4-7]。见图8。

图8 赤芍薄层色谱图

2.3 白驳丸中异补骨脂素、补骨脂素的含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（AgilentSB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温40℃，流动相采用甲醇-水（55∶45）；检测波长为246 nm[4-8]。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取适量的异补骨脂素、补骨脂素对照品适量，用甲醇制成每1 ml 含异补骨脂素20.36 μg、补骨脂素20.44 μg 的混合溶液，即得对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 取三批样品1904073、1912022、2002026 各10 袋，粉碎成细粉，混合均匀，分别精密称定6 g，置索氏提取器中，精密加入甲醇适量，加热回流提取2 h，冷却后转移至100 ml 量瓶中，用甲醇定容至100 ml，摇匀后过滤，所得滤液作为供试品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液制备 按白驳丸处方，取除去补骨脂的其他药材饮片，按白驳丸的制备方法及供试品溶液制备方法制成补骨脂阴性对照溶液。

2.3.5 专属性试验 分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液和补骨脂阴性对照溶液，按照“2.3.1”项下的色谱条件来测定，记录色谱图，结果见图9。可见本实验采用的色谱条件下补骨脂阴性对照无干扰，专属性强。

图9 补骨脂素及异补骨脂素的含量测定高效液相色谱法图谱

2.3.6 线性关系的考察 分别精密吸取混合对照品溶液1、3、6、9、12、15 μl，按“2.3.1”项下的色谱条件测定各个峰面积，继而以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），求得异补骨脂素回归方程Y=4585.4X-25.979（r=0.9999），补骨脂素回归方程Y=8387.5X-17.875（r=0.9999），表明异补骨脂素在0.0204～0.3054 μg 范围内、补骨脂素在0.0204～0.3066 μg 范围内进样量与峰面积积分值具有良好的线性关系。

2.3.7 精密度试验 混合对照品溶液进样10 μl，连续6 次，测定峰面积，结果补骨脂素峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.35%，异补骨脂素峰面积RSD 值为0.44%，表明所用仪器具有良好的精密度。

2.3.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液（1912022）10 μl，分别于0、2、4、6、8 h 进样，测定峰面积，计算补骨脂素峰面积的RSD 值为1.71%，异补骨脂素峰面积的RSD 值为1.64%，表明供试品溶液在8 h 内具有良好稳定性。

2.3.9 重复性试验 取6 份同一批号的白驳丸样品（1912022），分别采用“2.3.3”项下供试品溶液的制备方法制备白驳丸供试品溶液，采用“2.3.1”项下的色谱条件进行测定，进样量为10 μl，测得峰面积值并计算异补骨脂素、补骨脂素含量，结果异补骨脂素含量RSD 值为1.26%，补骨脂素含量RSD 值为1.78%，重复性试验符合要求。

2.3.10 回收率试验 ①对照品溶液制备：分别精密称取异补骨脂素对照品10.18 mg、补骨脂素对照品10.22 mg，放置于同一个50 ml 的量瓶中，采用甲醇定容，制成异补骨脂素0.2036 mg/ml、含补骨脂素0.2044 mg/ml 的溶液，即得。②样品溶液制备：精密称取6 份已知含量的同一批号白驳丸样品（1912022），分别加入补骨脂素1 ml，异补骨脂素4 ml，其余步骤按照“2.3.3”项下供试品溶液制备方法进行操作，采用“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。见表1～2。

表1 补骨脂素回收率

表2 异补骨脂素回收率

2.3.11 样品测定 取3 个批号的白驳丸样品，采用“2.3.3”项下供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，采用“2.3.1”项下的色谱条件进样10 μl，测定异补骨脂素、补骨脂素的峰面积，计算其含量。见表3。

表3 三批白驳丸含量测定结果（mg/g）

3 讨论

白驳丸的生产工艺为药材细粉用水制成水丸；而中药粉末的专属性鉴别方法即为显微鉴别，不仅专属性强，更具有检测成本低、操作简单的特点。因此，本研究利用显微鉴别法鉴别了鸡血藤药材的晶纤维、蒺藜药材内果皮的木化纤维、红花药材的花粉粒、黑豆药材具有光辉带的紫红色种皮珊状细胞及防风药材充满金黄色分泌物的油管，这些显微特征易于观察且专属性强。当归、首乌藤的TLC 鉴别以乙醚提取物作为供试品，鉴别其弱极性成分，在365 nm 紫外光灯下荧光斑点清晰，阴性均无干扰。赤芍的TLC 鉴别以芍药苷作为对照，显色后日光下检视，供试品色谱在相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰，重现性好。

白癜风是一种皮肤黏膜色素脱失性皮肤病[10]，具有原发性、局限性或泛发性，表现为皮肤、黏膜、毛发等的黑色素细胞出现选择性减少甚至消失从而引发白斑、灰发或白发[11]，肤色深的人群比肤色浅的发病率高，我国人群患病率为0.1%～2.0%[12]。白癜风在祖国医学古籍中多有记载，古今同名，且中西医病名相同[13]。目前，现代医学还未形成较为理想的治疗白癜风的方法，而祖国医学近年来对于本病的治疗取得满意效果[14]。大部分医家都是在辨证论治的基础上，借鉴现代药理学研究的成果，以增强疗效[15]。目前中医对白癜风的病因病机的认识中，多数认为白癜风是由机体内因与外因相互作用导致的。外因主要是风邪外侵，内因是由情志内伤、肝气郁结、气机不畅，心火肺热或脾胃虚弱、肝肾不足等脏腑失调，导致皮肤气血失和，瘀阻脉络[16]，欧阳恒认为发病机制为“气血失和，久病成瘀”[17-18]。白驳丸具有散风活血、补肾通络之功，临床应用多年，疗效确切。补骨脂具有温肾助阳之功，为治疗白癜风的主要药物[19]，黄曼萍等[20]通过查阅文献采集264 首治疗白癜风的外用处方，从白癜风外用药物频次统计来讲，补骨脂位列第一[21]，补骨脂颜色为深色，中药色象理论是在辨证理论的基础上加入了以色治色的思想[22]。在白癜风的治疗中能够促进黑色素细胞的迁移和黑色素合成[23-24]，补骨脂中所包含活性成分种类比较多，现已能够分离出一些化合物[25-26]。补骨脂素属于天然的呋喃香豆素类化合物，在抗肿瘤、抗病毒、治疗白血病、治疗白癜风皮肤顽疾等多方面的临床应用广泛[27]。

白驳丸治疗白癜风，临床应用多年。本文选择其主要成分补骨脂素和异补骨脂素进行含量测定，方法学考察结果符合要求，方法简便易行，专属性良好，为临床用药提供质量保证。