基于网络药理学探究益气化痰方治疗新型冠状病毒肺炎的分子机制

陈雪晴 刘雁锥 冯 静 罗苑苑 李 姗

1.广州中医药大学第一附属医院检验科，广东广州 510040；2.广东省遂溪县人民医院检验科，广东遂溪 524300；3.河南大学附属郑州颐和医院呼吸内科，河南郑州 450046；4.广州中医药大学第一附属医院重症医学科，广东广州 510040；5.河南中医药大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，河南郑州 450046

2019 年12 月以来，新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）在全球多个国家和地区肆虐，其传播迅速、传染性强，严重威胁着人们的健康，制约着社会经济的发展，已被世界卫生组织列为全球性大流行病[1]。因此，寻求有效的治疗药物仍然是防疫工作的重点[2]。

炎症反应是COVID-19 的主要病理机制之一。当机体感染病毒后，多种细胞因子激活并释放，当细胞因子大量积聚，就会造成炎症风暴，免疫调控失衡，患者病情恶化，出现呼吸窘迫综合征、脓毒症休克甚至器官功能衰竭[3]。炎症风暴发病前征兆少，发病后救治难度大，虽然可以通过西药来控制炎症风暴，但药物的毒副作用会使治疗陷入进退两难的境地[4]。中医阴阳调和，辨证论治，从整体方面调控机体，已经在COVID-19 的治疗中彰显出独特的优势[5]。在我国COVID-19 确诊病例中，中医药使用覆盖率达91.5%，有效率达90%以上[6]。因此，对中医药抗COVID-19 的分子机制进行研究，有针对性地减轻炎症风暴，对于防止病情恶化、改善疾病预后具有重要意义。

益气化痰方由白术、党参、茯苓、橘红、半夏、枳实和甘草7 味中药组成，是在四君子汤和六君子汤的基础上加减变化而来。该方加重理气化痰药后，对于肺部疾病有很好的疗效，特别是对于脾虚生湿，湿聚为痰的咳嗽、咳痰患者疗效显著。“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，用该方治疗可一举两得。研究显示，慢性阻塞性肺疾病肺脾气虚型患者，益气化痰方具有良好疗效，但作用机制还有待于进一步研究[9]。《COVID-19诊疗方案（试行第八版）》[7]中提出，恢复期COVID-19存在肺脾气虚证，其推荐处方与益气化痰方有异曲同工之效。本研究拟通过网络药理学预测并筛选益气化痰方的活性成分，探讨其治疗COVID-19 的分子机制，为该方的进一步研究和临床应用提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 益气化痰方生物活性成分筛选

利用TCMSP（http：//tcmspw.com/）检索益气化痰方中药成分，获取所有中药成分的生物化学信息，包括分子名称、相对分子质量、油水分配系数、类药性质（drug-like properties，DL）和口服生物利用度（oral bioavailability，OB）。基于经典药代动力学参数：吸收、分布、代谢、排泄进行筛选，确定以OB≥30%，及DL≥0.18 为初步筛选条件[8]。

1.2 益气化痰方生物活性成分潜在靶点分析

将在TCMSP 数据库中获取益气化痰方活性成分的靶蛋白名称输入Uni-prot 数据库（http：//www.uniprot.org/）绘制相应的Gene Symbol。

1.3 药物活性成分-靶点蛋白网络图构建

将益气化痰方药物组成、对应活性成分及预测靶蛋白名导入Cytoscape 3.6.1 软件中，构建药物-成分-靶点网络图[9]。

1.4 构建药物与疾病交集基因图

基于GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库，以“Corona Virus Disease 2019”为关键词进行检索，与药物潜在靶点共同导入Venny 2.1 平台，构建药物治疗疾病潜在基因图。

1.5 靶点蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络图构建

将益气化痰方与COVID-19 治疗相关的共同靶点通过String 数据库和Cytoscape 3.6.1 软件构建靶标PPI 网络图。

1.6 GO 功能分析与KEGG 富集分析

将益气化痰方治疗COVID-19 的交集核心靶点导入DAVID 6.8 数据库进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。选择物种为智人，依据通用标准，设置筛选条件为：Count≥4，P ≤0.05，错误发现率≤0.05，得到生物过程富集和通路富集[10]。

2 结果

2.1 益气化痰方活性成分筛选收集

初步筛选出145 个益气化痰方活性成分，包括白术4 个，党参17 个，茯苓6 个，橘红7 个，半夏12 个，枳实19 个，甘草88 个，其中共有活性成分为7 个（MOL0 04328 成分重复计算一次）。见表1。

表1 益气化痰方药物组成的共有活性成分

2.2 益气化痰方活性成分靶点预测

共得到药物交互作用靶点267 个，并成功构建药物-活性成分-靶点蛋白网络图，得到421 个节点，2766 条边，见图1。图中六边形节点代表益气化痰方药物组成，倒三角形节点代表益气化痰方主要活性成分，圆形节点代表药物作用的潜在基因靶点。每条边表示节点间的相互作用关系，一个节点与其他节点间的连线越多，代表其重要性越大，与其他的靶点联系越密切。

图1 药物-成分-靶点网络图

2.3 益气化痰方治疗作用靶点网络构建

共得到COVID-19 相关基因251 种。导入药物与疾病的相关基因，取其交集，共得到56 个益气化痰方治疗COVID-19 的潜在靶点，见图2。将56 个靶点导入String 数据库，构建PPI 网络图获得关联靶蛋白55个，其中超过平均度值的靶蛋白有30 个，图中节点大小与颜色和节点度值呈正比，见图3。拓扑分析后筛选的关键靶点为MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、TP53、CASP3、FOS，见图4。

图2 益气化痰方与COVID-19 靶点Venn 图

图3 益气化痰方PPI 网络图

图4 益气化痰方治疗COVID-19 的网络拓扑图

2.4 GO 富集分析与KEGG 通路分析

GO 富集分析和KEGG 通路分析，获得选择72 个GO 富集条目，包含生物学过程（biological process，BP）57 个，分子功能（molecular function，MF）11 个，细胞组分（cellular component，CC）4 个，对前20 个生物学过程、分子功能和细胞组成进行可视化分析。结果显示，益气化痰方主要涉及药物反应、炎症反应、免疫应答等多个BP；主要包括蛋白质结合、酶的结合和细胞因子活性等MF；并参与了胞质、线粒体、细胞外空间、细胞外区域的组成，见图5。KEGG 通路分析获得25 条通路，主要富集于美洲锥虫病、乙型肝炎、肺结核、百日咳、癌症通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路，见图6。

图5 益气化痰方治疗COVID-19 的GO 分析

3 讨论

在全国人民的共同努力下，我国的COVID-19 疫情已然得到很好的控制，但境外感染者的输入和无症状感染者的存在，给疫情的防控带来新的压力和挑战。中医药历史悠久，传承数载，在抗疫的关键时期发挥了显著的疗效。对中医药的进一步挖掘和开发能够为COVID-19 的防治提供新的策略和思路。

临床资料显示，COVID-19 患者热毒明显，常见高热持续不退、咳嗽频作、痰多质黏等症状[11]。益气化痰方中党参、白术补气健脾，白术兼能燥湿，茯苓既可健脾，又能利水渗湿，三药合用共奏健脾益肺，补益后天之功效[12]；半夏辛温，善治脏腑湿痰；甘草，味甘，性平，具有补脾益气，祛痰止咳，调和诸药之功效[13-14]；加之橘红、枳实理气宽中，燥湿化痰。全方配伍严谨，具有健脾益气、化痰祛湿的功效。从现代医学角度，COVID-19 是由病毒感染引起的炎症性疾病，抗炎、抗病毒是治疗COVID-19 的重要措施。益气化痰方中的7 味中药均显示了抗炎、抗感染或抗病毒功效[15-19]。经活性物质筛选发现，该方的有效成分主要有甾醇类化合物豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇等，和黄酮类化合物柚皮素、木犀草素、香蜂草苷等。文献报道，甾醇类化合物和黄酮类化合物具有广泛的抗炎、抗病毒作用[20]。例如，豆甾醇、β-谷甾醇均能降低炎症模型中巨噬细胞的活力和吞噬力，减少细胞因子一氧化氮、TNF-α 的生成[21]；柚皮素可改善大鼠脑出血后的炎症损伤[22]，还具有抑制登革热病毒复制的能力[23]；木犀草素可改变巨噬细胞M1/M2 的极化，通过下调p-STAT3 和上调p-STAT6 发挥抗炎作用[24]，还能抑制巨细胞病毒的复制发挥抗病毒作用[25]。

炎症风暴在COVID-19 病情的恶化中起到了重要作用，是导致重症、危重症患者死亡的重要原因。炎症风暴发病机制复杂，益气化痰方多功能、多靶点、多途径的独特优势，有助于从源头阻断炎症风暴的发生。益气化痰方主要涉及炎症反应、免疫应答、凋亡过程及凋亡正负调控等多个生物学过程，并且主要富集于美洲锥虫病、乙型肝炎、肺结核、百日咳等感染性疾病及TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路等多条通路。COVID-19 是感染性疾病，炎症反应贯穿于疾病的始终，而TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路中的关键分子可参与调控炎症反应和免疫应答过程[26]。既往研究通过分子对接预测甘草与TNF 和PPARD 相关靶点蛋白具有较强的结合能力。Toll 样受体信号通路作为天然免疫的重要组成部分，而网络药理学预测甘草与免疫相关受体具有较强的结合能力，在正向调控分子功能方面可能发挥关键作用[27]。益气化痰方干预COVID-19 的关键靶点主要为丝裂原活化蛋白激酶家族成员（MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14）和细胞因子（IL-6、IL-10、TNF），MAPK 信号通路在炎症细胞的增殖、分化和产生过程中起着关键的作用，并参与急性肺损伤的发生[28]。IL-6、IL-10 和TNF-α 参与肺部炎症的发生发展，其中IL-10、TNF-α在COVID-19 重症患者血清中显著升高，可能是病情恶化的重要指标[29]，而IL-6更是诱发炎症风暴的重要细胞因子[30]。研究表明，使用抗IL-6 受体的单抗类药物有望缓解COVID-19 重症患者的肺炎症状，降低疾病的死亡率[31]。本研究中益气化痰方活性成分所含的柚皮素能通过抑制MAPK信号通路减少人支气管上皮IL-6 的分泌，减轻脂多糖所诱导的支气管上皮损伤[32]；所含的木犀草素则能抑制肺组织中IL-6 的表达，使脓毒症小鼠急性肺损伤有所减轻[33]，提示益气化痰方亦能减轻COVID所致的肺部炎症和损伤，改善患者的临床症状，防止炎症风暴的发生。

综上所述，本研究应用热门的网络药理学进行预测分析，筛选出益气化痰方的主要活性成分、潜在靶点及可能的作用机制，为该经验方应用于COVID-19的对症治疗提供了理论支持，也为传统中医药的开发利用、合理配伍提供了科学参考。鉴于中药复方起效缓慢，个体差异较大，对COVID-19 患者应尽早实施中医药干预治疗，及时调整优化治疗方案，以期获得最佳治疗效果。本研究是对益气化痰方用于治疗COVID-19 可行性的理论数据分析，尚缺乏临床用药数据，预测的药物有效成分及其作用靶点仍需进一步体内外实验验证。