基于网络药理学探究丹参-骨碎补药对治疗股骨头坏死的作用机制

陈 中 郑 阳 仇湘中 张信成 尹晨东

1.湖南中医药大学研究生院，湖南长沙 410006；2.湖南省中医药研究院附属医院骨伤科，湖南长沙 410006

股骨头坏死是指因各种原因导致股骨头血供中断或减少，引起局部骨细胞缺血、变性、坏死，骨结构破坏，最终导致股骨头塌陷的严重骨关节炎[1]。我国股骨头坏死发病率逐渐年轻化[2]。洪坤豪等[3]、王丹丹等[4]、黄佳敏等[5]采用数据挖掘技术发现丹参、骨碎补出现频率较高，郭会卿、仇湘中等骨伤名家也将丹参、骨碎补作为其治疗股骨头坏死的核心药对[6-7]。由此可见，丹参-骨碎补药对在中医药治疗股骨头坏死处方中有重要作用。

1 资料与方法

1.1 丹参-骨碎补药对的活性成分和靶点的获取

分别以中药名“丹参”“骨碎补”在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数据库下载ingredients、targets；根据ADME 筛选模型，数据标准为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18。将获得的丹参和骨碎补的genesymbol导入UNIPORT 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）进行标准化处理。

1.2 股骨头坏死相关靶点的获取

以“Osteonecrosis of the femoral head ”为关键词，物种限定为人类，分别在GeneCards、OMIM 数据库中检索股骨头坏死相关靶点，获取股骨头坏死相关靶点信息。

1.3 丹参-骨碎补药对与股骨头坏死相交靶点的获取

通过R 软件将丹参-骨碎补药对相关潜在靶点与股骨头坏死的潜在靶点取交集并绘制维恩图。

1.4 药物-活性成分-股骨头坏死靶点蛋白互作网络

将丹参-骨碎补药对活性成分及治疗股骨头坏死潜在靶点导入STRING 数据库，选择Multiple protein，限定物种为人，获取靶标蛋白互作网络关系；利用R软件，将蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）数据导入，得知基因的连接节点数，绘制丹参-骨碎补治疗股骨头坏死的关键靶点图。

1.5 丹参-骨碎补药对治疗股骨头坏死潜在靶点GO和KEGG 富集分析

将药物与疾病交集潜在靶点基因运用R 软件的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor），设定p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05对这些潜在作用靶点进行KEGG 和GO 功能富集分析，绘制GO 功能富集与KEGG 富集分析气泡图。

2 结果

2.1 丹参-骨碎补药对活性成分

通过TCMSP 数据库筛选获得丹参有效活性成分52 个，骨碎补有效活性成分18 个，药物活性成分包括木犀草素、山柰酚、丹参酮Ⅱ A、柚皮素、β-谷甾醇等70 个。见表1。

表1 丹参-骨碎补药对有效成分

2.2 丹参-骨碎补药对治疗股骨头坏死潜在靶点筛选结果

丹参和骨碎补共获得158 个潜在靶点；通过GeneCards 数据库，设置数据标准Relevance score≥8获得股骨头坏死靶点基因590 个，OMIM 数据库获得68 个，合并之后删除重复项获得不同的股骨头坏死作用靶点639 个。二者映射得67 个交集靶点。见图1。

图1 丹参-骨碎补药对相关潜在靶点-股骨头坏死潜在靶点维恩图

2.3 丹参-骨碎补药对治疗股骨头坏死调控网络的构建

运用Cytoscape 3.7.2 软件，绘制丹参-骨碎补药对-股骨头坏死调控网络。见图2。

图2 丹参-骨碎补治疗股骨头坏死调控网络

2.4 丹参-骨碎补药对治疗股骨头坏死的靶点基因蛋白互作网络及核心靶点的筛选

运用STRING 数据库获取靶标蛋白互作网络关系见图3；将PPI 数据导入R 软件通过网络拓扑结构绘制丹参-骨碎补治疗股骨头坏死的关键靶点图（图4），图形越大，关系越密切，筛选出11 个关键靶点，分别为IL-6、AKT1、TP53、VEGFA、JUN、MAPK8、TNF、MAPK3、PTGS2、CASP3、MAPK1。

图3 丹参-骨碎补治疗-股骨头坏死靶点蛋白质-蛋白质相互作用

图4 丹参-骨碎补治疗股骨头坏死的关键靶点

2.5 丹参-骨碎补药对与股骨头坏死交集靶点的GO和KEGG 富集分析结果

GO 功能富集显示靶点分子功能主要涉及炎症、细胞代谢、核染色质、蛋白质、酶、磷酸酶受体结合等，见图5；KEGG 通路富集分析获得163 条通络，经进一步筛选，主要与PI3K-Akt、MAPK、IL-17、癌症相关通路相关，将富集靶点数最多的前20 条通路绘制成KEGG 功能富集图，见图6。KEGG 通路所包含基因分析显示几乎每条通路都有核心靶点AKT、VEGFA、TNF、MAPK 的参与。

图5 丹参-骨碎补治疗股骨头坏死靶点GO 富集

图6 KEGG 通路富集信息

3 讨论

本研究筛选出药物有效成分包括木犀草素、山柰酚、丹参酮Ⅱ A、柚皮素、β-谷甾醇等。木犀草素能较好的与MMP1、MMP3 结合并下调其表达水平，抑制IL-1、TNF-α 等致炎因子水平从而缓解骨关节炎疼痛[12]。山柰酚能够明显提高大鼠血清Ca2+、Ⅰ型前胶原羧基端前肽水平、降低Ⅰ型胶原交联羧基末端肽含量，促进骨胶原生成减少[13]。柚皮素能显著下调p-p65 表达水平从而抑制NF-κB 活性[14]；β-谷甾醇可下调ERK1/2 和上调Bcl-2/Bax 水平[15]，Bcl-2/Bax 蛋白在细胞凋亡信号通路中起十分关键作用[16]。由上可知丹参-骨碎补的有效成分可调节IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因子水平，减少骨细胞凋亡。

本研究通过GO 分析后推测丹参-骨碎补可通过调节细胞基因表达、抗氧化应激反应、抗炎症因子等过程治疗股骨头坏死，其中尤以细胞生物学过程最为重要。KEGG 富集分析发现4 个核心靶点AKT、VEGFA、TNF、MAPK。AKT 主要存在于静止细胞的细胞浆内，是PI3K 的下游效应因子，AKT 可正调节NF-κB信号通路，进而降低TNF-α、IL-1β 的表达，从而抑制细胞凋亡[17-18]；VEGFA 是VEGF 家族的一员，有研究表明[19-21]VEGFA 可上调VEGF mRNA 表达，血管内皮细胞可增加miRNA-210 脱甲基化表达，促进微血管内皮细胞活性和分化，丹参酮Ⅱ A 可诱导VEGF 表达，刺激血管修复和新血管形成[22-23]，Zhang 等[24]研究发现VEGF 还可促进MSCs 向成骨细胞分化；因此VEGF 的表达量可影响股骨头微循环和骨组织修复再生。TNF-α 是由活化的单核/巨噬细胞产生，TNF-α可损伤血管内皮细胞导致血管功能紊乱；MAPK 包括p38、JUK、ERK 三条主要信号通路，Ma 等[25]结果表明p38 通路在TGF-β1 诱导的骨髓间充质干细胞软骨分化中被激活，TGF-β1 可上调SOX9、胶原蛋白Ⅱ、聚集蛋白聚糖和GAG 表达水平，骨形成被抑制。现有研究发现[26]JUK1、JUK2 广泛存在于各种组织中，JUK3仅存在于脑、心脏等，JUK 信号通路被TNF-α 等炎症因子磷酸化后，炎症因子的表达量也相应降低，从而发挥抗骨关节炎作用。周毅等[27]研究发现川骨片上调SANFH 家兔股骨头组织ERK1/2 的表达、抑制JNK、p38 表达，从而促进成骨细胞的形成和抑制破骨细胞的形成，发挥治疗股骨头坏死作用。