口腔扁平苔藓患者外周血中ASH1L及其相关调控因子表达与免疫功能相关性

王方方 汪 鹰 蔡 扬

1.贵州医科大学口腔医学院，贵州贵阳 550004；2.四川大学华西口腔医院种植修复科，四川成都 610000；3.贵州医科大学附属口腔医院牙周黏膜科，贵州贵阳 550004

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种较常见的口腔黏膜慢性炎症疾病，一般认为T 细胞介导的免疫应答紊乱在其发病机制起重要作用[1-3]。ASH1L是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，可负向调控白细胞介素（interleukin，IL）-6 分泌并参与多种基因的转录激活[4-5]。泛素编辑酶A20 是一种抗炎蛋白[6]，IL-6 为一种参与免疫反应的多功能细胞因子[7]，两者在炎症和免疫调节中发挥重要作用[8-10]。研究表明ASH1L可诱导活化A20，通过A20 的去泛素化修饰负向调控IL-6，保护机体抵抗自身免疫性疾病[11-12]。本研究通过分析OLP 患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中ASH1L、A20、IL-6 表达与免疫功能的相关性，探讨其在OLP 免疫发病机制中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018 年8 月至2019 年8 月于贵州医科大学附属口腔医院（以下简称“我院”）就诊的40 例OLP初诊患者（OLP 组），其中男14 例，女26 例；年龄18～71 岁，平均（41.6±7.9）岁。另选择我院同期20 名体检健康的志愿者（对照组），其中男12 名，女8 名；年龄20～54 岁，平均（37.0±6.4）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。纳入标准：参照《口腔黏膜病学》[13]OLP 诊断标准，结合临床表现和组织病理学检查确诊为OLP。排除标准：①1～3 个月内使用过抗生素、糖皮质激素等相关药物；②伴有全身免疫系统性疾病；③妊娠及哺乳期女性。本研究经我院医学伦理委员会审批，受试者均知情同意。

1.2 检测方法

反转录试剂盒（RR047A）、SYBRGreen 荧光定量试剂盒（RR820A）均购自大连宝生物有限公司；美国Bio-Rad CFX96 荧光定量PCR 仪、美国BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，见表1。抽取两组空腹静脉血5 ml，其中2 ml采用散射比浊法检测体液免疫指标，另外3 ml采用乙二胺四乙酸抗凝，分别用于提取PBMC，应用流式细胞术分析淋巴细胞亚群百分比。采用实时荧光定量PCR 进行提取总RNA，总RNA 定量及纯度检测后按说明合成cDNA、配制PCR 反应体系，设置反应条件：95℃10 min，95℃10 s，60℃15 s，共40 个循环，采用2-△△Ct 法[14]对各基因进行相对定量分析。

表1 基因引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 对所得数据进行统计学分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，偏态分布计量资料的描述以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。计数资料采用例数表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞免疫指标水平比较

OLP 组中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、总T+B+NK细胞水平均低于对照组，CD19+、CD4+/CD8+比值均高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 两组细胞免疫指标水平比较（）

表2 两组细胞免疫指标水平比较（）

注：OLP：口腔扁平苔藓

2.2 两组体液免疫指标水平比较

OLP 组IgM 水平高于对照组，补体C3、C4 水平均低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 两组体液免疫指标水平比较（mg/L，）

表3 两组体液免疫指标水平比较（mg/L，）

注：OLP：口腔扁平苔藓

2.3 两组ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相对表达量比较

OLP 组ASH1L 及A20 mRNA 相对表达量低于对照组，IL-6 mRNA 高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表4。

表4 两组ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相对表达量比较[M（P25，P75）]

2.4 OLP 组ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相对表达量与免疫功能指标相关性分析

OLP 组ASH1L mRNA 相对表达量与IgG 水平呈正相关（r ＞0，P ＜0.05）。A20 mRNA 相对表达量与CD8+、IgA 水平呈正相关（r ＞0，P ＜0.05），与CD4+/CD8+呈负相关（r ＜0，P ＜0.05）。见表5。

表5 OLP 组ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相对表达量与免疫功能指标相关性分析

3 讨论

OLP 是一种以T 细胞浸润为特征的自身免疫性疾病[15-17]，ASH1L 为高度保守的组蛋白甲基化转移酶，通过A20 去泛素化修饰抑制IL-6 表达，在体内具有保护作用[18-19]。本研究OLP 组PBMC 中ASH1L、A20相对表达量低于对照组，且二者呈正相关，提示随ASH1L 表达减弱，局部炎症微环境持续活化，其诱导A20 活化的能力下降而导致A20 相对表达不足，在机体内所发挥的抗炎作用有限。二者表达水平下降可能是由于其向OLP 病损部位迁移，血液中相对缺乏表达ASH1L 与A20 的细胞，这与OLP 组二者表达水平下降的结果相一致[20]。本研究结果显示，A20 表达下调，与在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中研究结果一致[9，21]。本研究提示ASH1L 表达水平下调、抑炎作用减弱时，IL-6 水平升高，OLP 炎症程度随之加重。IL-6 表达水平升高，提示PBMC 可能是OLP 患者血清IL-6 来源，反映了OLP 患者机体慢性炎症状态。研究[22-24]发现IL-6 过度合成可参与自身免疫性疾病发展过程，可作为检测疾病活动的生物标志物。OLP组中A20 的表达水平与CD8+、IgA 呈正相关，与CD4+/CD8+呈负相关，推测A20 的表达下降与CD8+向局部病损组织迁移有关，A20 可能通过影响T 细胞功能参与OLP 特应性免疫应答过程。

综上，本研究发现ASH1L 及相关调控因子在OLP 患者外周血PBMC 中表达异常且与免疫指标有关，在OLP 免疫发病机制中发挥了一定作用。