CHB患儿干扰素α1b长期给药后血清β2-微球蛋白浓度的影响因素分析

柴燕涛 王福川 侯 俊 贾 凡 刘 佳 姜棋予 张 敏 毕京峰▲

1.中国人民解放军总医院第五医学中心感染病医学部，北京 100039；2.中国人民解放军总医院第五医学中心肝病医学部，北京 100039；3.中国人民解放军总医院第五医学中心临床检验中心，北京 100039；4.中国人民解放军总医院第五医学中心临床输血科，北京 100039

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是影响我国人民健康的一个重大疾病[1]。截至2018 年4 月，我国慢性乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B，HBV）感染者9300 万人，慢性肝炎患者高达2000 万人[2-3]，其中1～4岁、5～14岁和15～29岁人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）流行率分别为0.32%、0.94%和4.38%[4]。乙型肝炎E 抗原（hepatitis Be antigens，HBeAg）阳性孕妇为7.00%～11.00%，HBeAg阴性孕妇为0%～1.00%[5-6]，新生儿及1岁以下婴幼儿的HBV 感染慢性化风险为90.00%[7]。干扰素-α（interferon-α，IFN-α）已被我国批准用于儿童患者的治疗[8]，由于β2 微球蛋白的体内浓度-时间曲线与IFN的体内药-时曲线有相似的趋势，是公认的药效学指标[9-12]。然而，在连续给药，尤其儿童患者在长期给药后，疗程、年龄、性别等因素是否影响β2-微球蛋白的血清浓度尚不明确，客观上可能影响其能否作为药效学指标应用于儿童长期给药药代/药效学联合研究的效果。本研究已获中国人民解放军总医院第五医学中心（以下简称“我院”）医学伦理委员会的批准。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017 年12 月至2019 年9 月于我院就诊的108例接受IFN α1b 治疗的门诊及住院CHB患者的血清样本，该样本参考欧洲“2013 ESPGHAN 儿童时期慢性乙型肝炎的诊治指南”[13]，符合CHB 临床诊断及IFN 治疗指征。纳入标准：①年龄1～16岁，男女不限；②基线血清丙氨酸氨基转移酶（aminotransferase，ALT）为正常值上限2～10 倍；③HBV DNA≥2.00×103IU/ml；④患者及家属签署知情同意书。排除标准：①合并其他病毒性肝炎或艾滋病；②合并重要系统、器官等的重大疾病；③合并智力异常、痴呆、精神病；④研究医生认为不适宜参与本研究；⑤接受过其他抗病毒药物治疗。

1.2 临床资料的采集与管理

①血液样本采集：所有样本均来自儿童进行生化检测时的剩余样本，台式高速冷冻离心机（Thermo 公司，Micro 21R）900 g，15 min 分离血清，置-70℃冰箱中保存待测。②制订儿童慢性乙型肝炎临床信息采集表，包括基本信息：联系方式、姓名、性别、年龄、民族、身高、体重、体重指数（body mass index，BMI）、生活习惯（吸烟、饮酒）、病史、临床诊断、病毒基因分型，详细记录血样采集前给药时间、血样采集时间、给药剂量。

1.3 β2-微球蛋白检测方法

①样品准备：完全融化后，混匀，900 g，10 min 后吸取上清，用样本稀释液稀释5000 倍，使稀释后的样本光密度（optical density，OD）值落在标准曲线对应的OD 值范围内，如果OD 值未在此范围内，再对稀释倍数进行相应调整。②试剂配制及操作方法：按照试剂盒[Human Beta-2 Microglobulin（B2M）SimpleStep ELISA Kit，货号：ab181423]说明书进行标准品工作液、Antibody Cocktail、洗液的配置，其中标准品工作液浓度由高到低分别为2000.00、1000.00、500.00、250.00、125.00、63.00、31.25 pg/ml。在板中按顺序加入50.00 μl稀释后样本、标准品工作液（均做2 个复孔）后，加入50.00 μl Antibody Cocktail，平板摇床（LE PARD 公司，Leopard V）室温400 r/min 反应1 h，洗板机（BioTek 公司，ELX50）洗板3 次，最后1 次用纸拍干。再加入100.00 μl TMB Develpoment Solution，平板摇床400 r/min 避光反应15 min 后，加入100.00 μl Stop Solution 平板摇床400 r/min 混匀1 min（注意避光），微孔板检测仪（BioTek 公司，Synergy H4）450 nm处读取OD 值。③结果分析：根据标准品工作液的浓度及各浓度对应的OD 值绘制标准曲线，然后用Origin软件对标准曲线进行曲线拟合，所有数据r2均＞0.90。将OD 值带入到曲线拟合的公式中，换算出各个样本的浓度，乘以稀释倍数即为样本的最终浓度。

1.4 样本量的确定依据

本研究拟应用多重线性回归分析相关影响因素。根据临床经验，预计纳入BMI、疗程、年龄、给药时间、HBV 基因型、给药剂量、性别等7 个自变量。考虑到多重线性回归分析要求样本量应为自变量个数的10～20 倍，拟纳入至少100例样本。

1.5 统计学方法

所有数据存储于Epidata 数据库。所有统计分析过程均基于SAS 9.4 完成。正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。偏态分布计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，采用Wilcoxon 秩和检验。计数资料以例数或百分比表示。采用Spearman 相关分析β2 微球蛋白与年龄、疗程、给药时间及BMI的关系。多重线性回归分析β2 微球蛋白的相关影响因素。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床信息基本情况

本研究共采集了108例患儿的血液样本，年龄1～16岁，中位年龄为5（4，7）岁；男性患儿64例（59.26%），女性患儿44例（40.74%）；全部为汉族；均无烟、酒史，均无其他疾病病史。中位BMI 为15.85（14.85，16.65）kg/m2；中位疗程为338（167，715）d；给药时间（采样时间与采样前最后1 次用药的间隔时间）为1123（842，2349）min；给药剂量≤40.00 μg 共47例（43.52%），＞40.00 μg 共61例（56.48%）；HBV 基因型中B型有20例（18.52%），C型有81例（75.00%），6例患者基因型缺失，1例为非B 非C型，故未纳入分析。

2.2 β2 微球蛋白与年龄、疗程、给药时间及BMI的相关性分析

β2 微球蛋白与年龄、疗程、给药时间及BMI 无相关性（P ＞0.05）。见图1。

图1 β2 微球蛋白与年龄、疗程、给药时间及BMI的相关性分析

2.3 不同性别、HBV 基因型、给药剂量β2 微球蛋白的比较

不同性别、HBV 基因型、给药剂量β2 微球蛋白，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 不同性别、HBV 基因型、给药剂量β2 微球蛋白的比较

2.4 血清β2 微球蛋白浓度影响因素的多因素分析

将血清β2 微球蛋白浓度作为因变量，性别（女=1，男=2）、给药剂量（≤40.00 μg=1，＞40.00 μg=2）、HBV基因型（C型=1，B型=2）、年龄、给药时间、疗程、BMI作为自变量引入模型以α=0.1 为检验水准。给药剂量、年龄、给药时间、疗程是影响血清β2 微球蛋白浓度的相关因素（P ＜0.05），其中血清β2 微球蛋白浓度伴随给药剂量的升高而升高，伴随年龄、给药时间及疗程的增大而降低。见表2。

表2 血清β2 微球蛋白浓度影响因素的多重线性回归分析

3 讨论

β2-微球蛋白是由99 个氨基酸构成的多肽，是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白[14-16]，是细胞中完整组织相容性抗原分子的一部分[17]。正常条件下，血中含量极微，生成量较恒定[18-19]，其主要生理作用为参与识别异己物质和提供杀伤细胞受体的作用[18]。由于分子量小，且不与血浆蛋白结合，故可自由通过肾小球，但原尿中的β2-微球蛋白约99.90%在近端肾小管被重吸收并降解，仅有微量约0.10%随尿液排出体外[20]，因此，β2-微球蛋白常作为肾损伤的标志物用于临床肾损伤检测[21-23]。

近年来，β2-微球蛋白常作为INF的药效学标志物[12,24]用于INF的药代/药效学研究，通常被解释为INF 结合β2-微球蛋白表面受体后触发的复杂细胞内反应的结果，刺激了患者体内抗病毒蛋白的合成[24-25]。多项研究显示，在单次给药后，β2 微球蛋白的体内浓度-时间曲线与INF的体内药-时曲线有相似的趋势[12,21]，但缺乏连续给药后，β2-微球蛋白影响因素的相关证据，客观上可能影响其能否作为药效学指标应用于长期给药的药代/药效联合研究的效果。

本研究基于108例1～16岁应用IFN α1b 治疗的CHB患儿，发现给药剂量、年龄、给药时间、疗程对血清β2-微球蛋白浓度均有显著的影响。其中，伴随给药剂量的升高，血清β2 微球蛋白浓度呈升高趋势，而伴随年龄、给药时间及疗程的增大，血清β2 微球蛋白浓度呈降低趋势。本研究提示，血清β2-微球蛋白的浓度不仅仅与给药剂量有关，给药时间、疗程及年龄也对血清β2 微球蛋白浓度具有一定的影响。

该研究存在的主要问题是，受伦理学的影响，只能应用住院儿童患者早上抽取的生化检测的剩余样本进行分析，导致多数患者的给药时间，即采样时间与采样前最后一次用药的间隔时间较长，一般大于12 h，属于间断数据，在“给药时间”这一指标的分析中可能存在一定的误差，寄希望于在未来的研究中进一步证实。