LncRNA PRNCR1靶向miR-653-5p调控鼻咽癌细胞恶性生物学行为

赵黎阳 崔玲 张颖 王玲 李会政

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其发病隐匿，且病情进展迅速，极大威胁人类生命健康［1-2］。目前，鼻咽癌的发病机制尚未明了。研究表明，鼻咽癌发生发展可能与原癌基因激活及抑癌基因失活有关［3］。因此，寻找影响鼻咽癌发生发展的基因分子，可能为鼻咽癌的治疗提供分子靶点。前列腺癌非编码RNA 1（prostate cancer non-coding RNA 1，PRNCRl）是一种前列腺癌相关基因，属于长链非编码RNA（lncRNA）家族成员。研究表明，PRNCRl可能通过调控雄性激素受体参与前列腺癌的发生，同时在舌鳞癌［4］、非小细胞肺癌［5］和乳腺癌［6］等肿瘤中呈高表达，并通过促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，阻碍细胞凋亡，进而促进肿瘤发展进程。有研究报道，PRNCR1在鼻咽癌组织中呈高表达［7］，但其对鼻咽癌细胞恶性表型的影响尚未见报道。lncRNA可通过竞争性结合微小RNA（miRNA）进而调控miRNA靶基因表达，参与调控肿瘤细胞恶性表型［8-10］。研究显示，miR-653-5p在胃癌［11］和宫颈癌［12］等肿瘤中发挥抑癌基因作用，上调其表达可阻碍肿瘤发展进程。本课题组通过Starbase靶基因软件预测显示，PRNCR1可能靶向结合miR-653-5p。在此基础上，本研究进一步检测鼻咽癌细胞系中PRNCR1和miR-653-5p的表达，探讨PRNCR1/miR-653-5p轴对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

鼻咽癌细胞系（5-8F、6-10B、C666-1）购自中国科学院上海细胞库；鼻咽上皮细胞NP69购自上海弘顺生物科技有限公司；RNA抽屉试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；RPMI 1640培养基、CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；PCR引物、PRNCR1小干扰RNA（si-PRNCR1）、乱序无意义阴性序列（si-NC）、miR-653-5p模拟物（miR-653-5p mimics）、模拟对照序列（miR-NC）、PRNCR1野生型质粒（WT-PRNCR1）及突变型质粒（MUT-PRNCR1）、miR-653-5p抑制剂（anti-miR-653-5p）及其阴性序列（anti-miR-NC）均由上海吉玛制药技术公司设计并合成。

1.2 细胞培养

鼻咽癌细胞系（5-8F、6-10B、C666-1）和鼻咽上皮细胞NP69复苏后，分别加入含10%FBS的RPMI 1640培养基，转移至25 cm2培养瓶，置于培养箱中培养。待细胞生长密度约为80%时，换液，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染及分组

将对数生长期的6-10B细胞按1.0×105/孔接种至6孔板中，按照LipofectamineTM2000脂质体法分别转染si-NC（si-NC组）、si-PRNCR1（si-PRNCR1组）、miR-NC（miR-NC组）、miR-653-5p mimics（miR-653-5p组），以及共转染si-PRNCR1与anti-miR-NC（si-PRNCR1+anti-miR-NC 组）、si-PRNCR1 与 anti-miR-653-5p（si-PRN-CR1+anti-miR-653-5p组）。转染12 h后，更换含10%FBS的RPMI 1640培养基，继续培养24 h。RT-qPCR法验证转染效果，并收集细胞备用。

1.4 RT-qPCR检测PRNCR1和miR-653-5p的表达水平

采用RNA抽屉试剂提取各细胞中的总RNA，逆转录生成cDNA后，进行PCR扩增。PCR反应体系共20 μL，包括10 μL SYBRPremixEx Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）、0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、2.0 μL cDNA 模板和 7.2 μL DEPC。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。引物序列：PRNCR1上游引物为5'-GAAGAGCGTGTCTTGG-3'，下游引物为 5'-CCTG-GCTTTCCTGGTTC-3'；miR-653-5p上游引物为5'-TT-GAAACATTCTCTACTGAAC-3'，下游引物为5'-GAA-CATGTCTGCGTATCTC-3'；GAPDH 上游引物为 5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，下游引物为 5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；U6上游引物为5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。以GAPDH和U6分别作为PRNCR1和miR-653-5p的内参，采用2−△△Ct法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次。

1.5 CCK-8法检测细胞的增殖能力

将各组细胞接种至96孔板中（2.5×104/孔），分别培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，用酶标仪检测波长在450 nm处的光密度（OD）值。OD值越大，说明细胞增殖能力越强。实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

将各组细胞接种至6孔板中（1.0×105/孔），培养48 h后，收集细胞。用500 μL结合缓冲液重悬细胞，添加10 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min；再加入5 μL PI，避光孵育5 min后，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.7 划痕实验检测细胞的迁移能力

将各组细胞接种至6孔板中（1.0×105/孔），培养4 h后，弃培养基。用200 μL移液器枪头在培养板底部平行于中轴线划两条平行线，并用PBS洗去划痕间细胞，测量划痕间距（d），记为d0h。更换新鲜培养基，继续培养24 h后，再次测量细胞间距d，记为d24h，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=［（d0h−d24h）/d0h］×100%。实验重复3次。

1.8 Transwell实验检测细胞的侵袭能力

将Transwell小室置于24孔板中，铺Matrigel基质胶，自然晾干。将各组细胞接种至Transwell上室（5.0×104/孔），另取500 μL培养基加至下室。培养48 h后，弃培养基，用多聚甲醛固定、结晶紫染色，在倒置显微镜下观察基质胶下层细胞，随机取5个视野计数侵袭细胞数。实验重复3次。

1.9 双荧光素酶报告基因实验验证PRNCR1和miR-653-5p的靶向关系

将对数期6-10B细胞接种至6孔板中（1.0×105/孔），按照LipofectamineTM2000脂质体法分别共转染miR-653-5pmimics与WT-PRNCR1、miR-NC与WT-PRNCR1、miR-653-5p mimics与MUT-PRNCR1、miR-NC与MUT-PRNCR1，转染12 h后，更换为含10%FBS的RPMI 1640培养基，继续培养24 h，收集细胞并裂解，3 500 r/min离心5 min后，取上清，用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性，结果以萤火虫荧光强度与海肾荧光强度的比值表示。实验重复3次。

1.10 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较用Tukey检验。以双侧P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRNCR1和miR-653-5p在鼻咽癌细胞系中的表达

RT-qPCR检测结果显示，鼻咽癌细胞系（5-8F、6-10B、C666-1）中PRNCR1的表达水平均高于鼻咽上皮细胞NP69（t=15.273、30.857、32.750，均P<0.001），而 miR-653-5p的表达水平则低于NP69细胞（t=5.000、48.000、33.000，均P<0.001），且均在 6-10B细胞中表达差异最明显，故选择6-10B细胞进行后续实验。见图1。

图1 鼻咽癌细胞系中PRNCR1和miR-653-5p的表达Fig.1 The expression of PRNCR1 and miR-653-5p in nasopharyngeal carcinoma cell lines

2.2 敲减PRNCR1对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

RT-qPCR检测结果显示，转染si-PRNCR1后鼻咽癌6-10B细胞中PRNCR1的表达水平低于转染si-NC的6-10B细胞（0.26±0.06vs1.00±0.00，t=37.000，P<0.001），表明敲减PRNCR1的6-10B细胞构建成功，见图2A。

CCK-8法和流式细胞术检测结果显示，si-PRNCR1组中6-10B细胞的OD值较si-NC组降低（t48h=9.025，P<0.001；t72h=12.083，P<0.001），而凋亡率高于si-NC组［（23.81±3.62）%vs（5.45±0.89）%，t=14.775，P<0.001］，见图2B～C。划痕实验和Transwell法检测结果显示，si-PRNCR1组6-10B细胞划痕愈合率和侵袭细胞数均低于si-NC组［（32.02±1.71）%vs（74.10±0.72）%，t=68.039，P<0.001；（53.89±6.05）个vs（124.44±10.55）个，t=17.403，P<0.001］，见图2D～E。表明敲减PRNCR1可阻碍鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移、侵袭，并促进其凋亡。

图2 敲减PRNCR1对6-10B细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响Fig.2 The effect of knocking down PRNCR1 on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of 6-10B cells

2.3 过表达miR-653-5p对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

RT-qPCR检测结果显示，转染miR-653-5p mimics的鼻咽癌6-10B细胞中miR-653-5p表达水平高于转染 miR-NC 的 6-10B 细 胞（2.83±0.06vs1.00±0.00，t=91.500，P<0.001），表明过表达miR-653-5p的6-10B细胞构建成功，见图3A。

CCK-8法和流式细胞术检测结果显示，miR-653-5p组中6-10B细胞的OD值低于miR-NC组（t48h=17.047，P<0.001；t72h=14.341，P<0.001），而凋亡率高于 miR-NC 组［（32.32±6.21）%vs（4.78±1.00）%，t=13.135，P<0.001），见图3B～C。划痕和Transwell实验检测结果显示，miR-653-5p组6-10B细胞划痕愈合率、侵袭细胞数低于miR-NC组［（28.22±1.62）%vs（73.50±0.84）%，t=74.440，P<0.001；（45.67±4.90）个vs（122.22±13.26）个，t=16.245，P<0.001］，见图3D～E。表明过表达miR-653-5p可抑制鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。

图3 过表达miR-653-5p对6-10B细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响Fig.3 The effect of overexpression of miR-653-5p on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of 6-10B cells

2.4 PRNCR1靶向负调控miR-653-5p表达

Starbase靶基因软件预测显示，PRNCR1与miR-653-5p的核苷酸序列存在结合位点，见图4A。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染miR-653-5p mimics与WT-PRNCR1的6-10B细胞荧光素酶活性低于共转染 miR-NC与 WT-PRNCR1的 6-10B细胞（0.24±0.02vs1.00±0.03，t=63.236，P<0.001），而共转染miR-653-5p mimics与MUT-PRNCR1的6-10B细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC与MUT-PRNCR1的6-10B细胞比较差异无统计学意义（0.99±0.04vs1.00±0.04，t=0.530，P=0.603），见图4B。RT-qPCR检测结果显示，si-PRNCR1组6-10B细胞中PRNCR1表达低于si-NC组（0.27±0.07vs1.00±0.00，t=31.286，P<0.001），而miR-653-5p 表达高于 si-NC 组（2.61±0.09vs1.00±0.00，t=53.667，P<0.001），见图4C。表明PRNCR1可靶向负调控miR-653-5p。

图4 PRNCR1靶向负调控miR-653-5p的表达Fig.4 PRNCR1 targeted and negatively regulated the expression of miR-653-5p

2.5 敲减miR-653-5p可逆转敲减PRNCR1对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用

RT-qPCR检测结果显示，si-PRNCR1+anti-miR-653-5p组6-10B细胞中miR-653-5p的表达水平低于si-PRNCR1+anti-miR-NC 组（1.35±0.08vs2.68±0.11，t=29.335，P<0.001），见图5A。

CCK-8法和流式细胞术检测结果显示，si-PRNCR1+anti-miR-653-5p组6-10B细胞OD值高于si-PRNCR1+anti-miR-NC 组（t48h=18.284，P<0.001；t72h=14.341，P<0.001），而凋亡率低于 si-PRNCR1+anti-miR-NC 组［（10.63±1.43）%vs（22.76±7.24）%，t=4.931，P<0.001］，见图5B～C。划痕和Transwell实验检测结果显示，si-PRNCR1+anti-miR-653-5p组 6-10B细胞划痕愈合率、侵袭细胞数均高于 si-PRNCR1+anti-miR-NC 组［（62.30±1.02）%vs（31.50±1.47）%，t=51.643，P<0.001；（94.56±11.28）个vs（54.22±5.85）个，t=9.524，P<0.001］，见图5D～E。表明敲减miR-653-5p可逆转敲减PRNCR1对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及凋亡促进作用。

图5 敲减miR-653-5p可逆转敲减PRNCR1对6-10B细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响Fig.5 Knocking down miR-653-5p reversed the effect of knocking down of PRNCR1 on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of 6-10B cells

3 讨论

lncRNA在真核生物中广泛存在，目前研究认为其异常表达与肿瘤发生发展密切相关［13-15］。已有研究表明，多种lncRNA在鼻咽癌中异常表达并参与其发展进程，可能是鼻咽癌治疗的潜在分子靶点。例如，lncRNA FAM225A通过与miR-590-3p和miR-1275结合，上调ITGB3表达，进而促进鼻咽癌发生和转移［16］；lncRNA GAS5在鼻咽癌中表达上调，下调其表达可通过靶向miR-4465/COX2轴抑制细胞增殖并促进细胞凋亡［17］；而敲低lncRNA FOXD3-AS1可通过改变miR-135a-5p的表达调节鼻咽癌细胞的生长和凋亡［18］。PRNCRl作为lncRNA家族的一员，已有研究表明其在舌鳞癌［4］、非小细胞肺癌［5］和乳腺癌［6］等肿瘤中具有促癌作用。在鼻咽癌中，有研究发现PRNCR1呈高表达，且与肿瘤临床分期、T分级和淋巴结转移等临床病理特征密切相关，可作为鼻咽癌预后不良的生物标志物［7］。本研究亦发现，PRNCR1在鼻咽癌细胞系中高表达，而敲减PRNCR1表达可抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，提示PRNCR1在鼻咽癌中可能作为促癌基因发挥作用，可能是鼻咽癌治疗的分子靶点。

为进一步研究PRNCR1促进鼻咽癌细胞恶性表型的分子机制，本研究通过Starbase靶基因软件及双荧光素酶报告基因实验证实PRNCR1可靶向结合并负调控miR-653-5p的表达，这与鼻咽癌细胞系中敲减PRNCR1而miR-653-5p表达升高的结果一致。研究显示，circ-RAD23B可通过靶向抑制miR-653-5p进而上调TIAM1表达促进非小细胞肺癌细胞侵袭，其中miR-653-5p在非小细胞肺癌中起抑癌基因作用［19］；黑色素瘤中AFAP1-AS1呈高表达，其通过靶向负调控miR-653-5p并促进RAI14的表达增强体外黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力及体内肿瘤生长［20］。本研究结果显示，过表达miR-653-5p可有效阻碍鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，且促进细胞凋亡；体外细胞功能实验表明，敲减miR-653-5p可逆转敲减PRNCR1对鼻咽癌细胞恶性表型的抑制作用，进一步提示PRNCR1可能通过靶向负调控miR-653-5p促进鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。

综上，鼻咽癌细胞系中PRNCR1呈高表达而miR-653-5p呈低表达；敲减PRNCR1表达能阻碍鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，且加速细胞凋亡，其作用机制可能与靶向负调控miR-653-5p有关，PRNCR1/miR-653-5p轴可能为鼻咽癌的治疗提供新的分子靶点。但PRNCR1/miR-653-5p轴对鼻咽癌发生发展的确切作用仍需进一步在体内验证，miR-653-5p下游靶基因及信号通路亦有待深入研究。