沙格列汀对1 型糖尿病小鼠GLP-1、胰高血糖素表达及胰岛α 细胞增殖、凋亡的影响①

2021-09-25吴美芬潘海燕刘裕晓黄兴丽韦晓丹

中国免疫学杂志 2021年16期

吴美芬潘海燕刘裕晓黄兴丽韦晓丹武革

（广东医科大学附属医院内分泌科，湛江524001）

糖尿病是世界范围内的常见病，长期易引发并发症，危害患者健康，近年其发病率逐渐升高。1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是自身免疫介导引起胰岛β 细胞破坏、凋亡增加的自身免疫性疾病，在糖尿病中所占比例低于T2DM，但其临床症状较严重，多累及年轻人[1］。研究发现，T1DM 患者的高血糖往往与高血糖素血症有关，而胰高血糖素由胰岛α 细胞分泌[2］。胰高糖素样肽1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）是一种促胰岛素肽，能促进胰岛β 细胞增殖并抑制其凋亡，主要由肠道L 细胞分泌，近年被发现可通过胰岛α 细胞合成胰高糖素原途径产生[3-5］。二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）抑制剂是近年广泛应用于糖尿病治疗的一类降糖药物，通过抑制GLP-1降解及胰高糖素分泌，增加体内胰岛素分泌发挥降糖作用[6］。沙格列汀是DPP4 抑制剂的一种，既往多用于治疗T2DM，临床疗效好，安全性高[7］。本研究将通过注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导建立T1DM 小鼠模型，研究沙格列汀对T1DM 小鼠GLP-1、胰高血糖素表达及胰岛α 细胞增殖、凋亡的影响，以期为临床治疗T1DM提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康C57BL/6小鼠55只，8～10 周龄，体重25～30 g（南方模式生物研究中心），严格按照小鼠饲养规则进行喂养，温度为25℃，湿度为50%，光照时间为8：00～20：00，饮用蒸馏水，饲养期间保持饲养房间整洁、通风，定时对鼠笼进行清理。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条例》要求。小鼠适应性饲养2周后用于后续实验。

1.1.2 主要试剂与仪器 STZ 自行配制：枸橼酸滴定生理盐水至pH值为4.2，然后进行高压灭菌，临用前以无菌酸化生理盐水将STZ 配制成2% 工作液。胰岛素（货号：0215504401）购自诺和公司；人GLP-1、人胰高血糖素ELISA 试剂盒、增殖细胞核抗原（pro‐liferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体、Ki-67 抗体、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体、GAPDH 抗体（货号：ab41969、ab267567、ab92552、ab15580、ab32503、ab181602）购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（货号：0295G-HRP）购自美国Santa 公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（货号：KFS197-SLG）购自北京百奥莱博科技有限公司；沙格列汀（货号：H20160088）购自阿斯利康制药有限公司；血糖仪（型号：HGM-114）购自达而泰（天津）实业有限公司；酶标仪（型号：MOD‐EL550）、化学发光成像系统（型号：ChemiDocXRS）购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备随机抽取45 只小鼠造模，剩余10 只作为正常组。造模前小鼠禁食不禁水12 h，称取空腹体重，按130 mg/kg STZ 给予小鼠单次腹腔注射。正常组小鼠同时间腹腔注射等量生理盐水。结束注射药物1 周后采集小鼠尾静脉血，测小鼠禁食6 h后血糖。连续2次血糖≥11.1 mmol/L诊断为T1DM。造模期间未连续2 次血糖≥11.1 mmol/L 者4 只，死亡1 只，造模成功的40 只小鼠继续后续实验。

1.2.2 动物分组及给药方法造模成功的小鼠随机分为模型组、胰岛素组、沙格列汀低剂量组、沙格列汀高剂量组（10 只/组）。胰岛素组皮下注射1 U胰岛素；沙格列汀低、高剂量组分别灌胃1、3 mg/（kg·d）沙格列汀，正常组、模型组小鼠均灌胃等体积生理盐水，1次/d，连续治疗4周。

1.2.3 血糖仪检测各组小鼠给药前后血糖水平

造模后各组小鼠于给药前、后禁食不禁水6 h 后采集尾静脉血，血糖仪检测血糖水平。

1.2.4 ELISA 法检测各组小鼠GLP-1 和胰高血糖素水平给药结束后，麻醉小鼠进行心脏采血，收集的血样静置3 h 分离血清。ELISA 法检测小鼠血清GLP-1 和胰高血糖素水平，操作方法均按照试剂盒说明书进行。使用酶标仪测定吸光度值，波长为450 nm，取3次重复平均值，根据标准液吸光度结果与标准液浓度绘制标准曲线，得出换算方程，计算GLP-1和胰高血糖素水平。

1.2.5 免疫组化检测各组小鼠胰岛α 细胞增殖情况取血后断颈处死，立即分离出胰腺组织，以体积分数0.9% 的冰生理盐水冲洗，用滤纸吸干残留水分。取近胰头的1/2 置于4% 多聚甲醛溶液中固定，24 h 后常规脱水透明，石蜡包埋，切片。将石蜡切片常规脱蜡水化，柠檬酸缓冲液修复抗原，滴加3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，10% 山羊血清室温湿盒封闭，加入PCNA一抗（1∶6000）4℃孵育过夜，PBS 冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5000）常温孵育1 h，PBS 冲洗，DAB 显色，水洗，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。利用ImageProPlus 图像分析系统采集图像，每张片子取5个高倍视野（×400），计算增殖指数，增殖指数=增殖细胞数/细胞总数×100%。

1.2.6 TUNEL 法检测各组小鼠胰岛α 细胞凋亡情况将石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸缓冲液修复抗原，滴加3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，滴加50 µl TUNEL 反应液，置于湿盒中，37℃孵育1 h，PBS 冲洗，滴加3%H2O2反应10 min，PBS溶液冲洗后，用含DAPI 的抗淬灭封片剂封片。利用ImageProPlus 图像分析系统采集图像，每张片子取5 个高倍视野（×400），计算凋亡指数，凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.7 Western blot 检测各组小鼠胰腺组织中Ki-67、Bax 蛋白表达 RIPA 裂解液裂解胰腺组织，4℃离心后提取蛋白并定量，电泳、转膜、封闭后加入Ki-67、Bax、GAPDH 一抗（1∶500），4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5000），室温孵育1 h，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.3 统计学分析数据处理采用SPSS24.0统计学软件。计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。当P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠给药前后血糖水平胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组给药后血糖水平均显著低于给药前（P<0.05）。给药前，与正常组相比，模型组小鼠血糖水平均显著升高（P<0.05）；模型组、胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠血糖水平差异无统计学意义（P>0.05）。给药后，与对照组相比，模型组小鼠血糖水平均显著升高（P<0.05）；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠血糖水平均显著降低（P<0.05）；胰岛素组与沙格列汀低剂量组小鼠血糖水平差异无统计学意义（P>0.05）；与胰岛素组、沙格列汀低剂量组相比，沙格列汀高剂量组小鼠血糖水平显著降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠给药前后血糖水平比较（±s，n=10，mmol/ L）Tab.1 Comparison of blood glucose levels before and af⁃ter administration（±s，n=10，mmol/ L）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；compared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05；com‐pared with before administration，5）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P Before administration 5.46±0.8217.57±1.241）17.32±1.331）17.68±1.411）17.63±1.291）191.6680.000 After administration 5.73±0.8817.98±1.351）15.16±1.181）2）5）15.74±1.201）2）5）13.56±0.971）2）3）4）5）172.9350.000

2.2 各组小鼠血清GLP-1 和胰高血糖素水平与正常组相比，模型组小鼠血清GLP-1水平显著降低，胰高血糖素水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠血清GLP-1水平显著升高，胰高血糖素水平显著降低（P<0.05）；胰岛素组和沙格列汀低剂量组小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平差异无统计学意义（P>0.05）；与胰岛素组、沙格列汀低剂量组相比，沙格列汀高剂量组小鼠血清GLP-1 水平显著升高，胰高血糖素水平显著降低（P<0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of serum GLP-1 and glucagon levels in each group（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with saxagliptin low dose group，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P GLP-1（mmol/ L）15.22±1.185.94±0.821）7.91±0.961）2）7.66±1.041）2）10.85±1.131）2）3）4）74.5480.000 Glucagon（pg/ ml）48.18±2.6466.84±2.851）59.59±2.881）2）62.02±2.951）2）54.68±2.731）2）3）4）38.6830.000

2.3 各组小鼠胰岛α 细胞增殖情况与正常组相比，模型组小鼠胰岛α 细胞增殖指数显著升高（P<0.05）；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠胰岛α 细胞增殖指数显著降低（P<0.05）；胰岛素组和沙格列汀低剂量组小鼠胰岛α细胞增殖指数差异无统计学意义（P>0.05）；与胰岛素组、沙格列汀低剂量组相比，沙格列汀高剂量组小鼠胰岛α细胞增殖指数显著降低（P<0.05）。见图1、表3。

图1 免疫组化检测各组小鼠胰岛α细胞增殖情况（×400）Fig.1 Proliferation of islet α cells was detected by immu⁃nohistochemistry（×400）

表3 各组小鼠胰岛α细胞增殖指数比较（±s）Tab.3 Comparison of proliferation index of islet α cells in each group（±s）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with the low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose FP n 1010101010− −Proliferation index（%）24.87±1.3344.63±1.421）35.16±1.151）2）34.57±1.281）2）30.44±1.321）2）3）4）310.2340.000

2.4 各组小鼠胰岛α 细胞凋亡情况与正常组相比，模型组小鼠胰岛α 细胞凋亡指数显著降低（P<0.05）；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠胰岛α 细胞凋亡指数显著升高（P<0.05）；胰岛素组和沙格列汀低剂量组小鼠胰岛α细胞凋亡指数差异无统计学意义（P>0.05）；与胰岛素组、沙格列汀低剂量组相比，沙格列汀高剂量组小鼠胰岛α细胞凋亡指数显著升高（P<0.05）。见图2、表4。

图2 TUNEL法检测各组小鼠胰岛α细胞凋亡情况（×400）Fig.2 Apoptosis of islet α cells was detected by TUNEL method（×400）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

2.5 各组小鼠胰腺组织中Ki-67、Bax 蛋白表达情况与正常组相比，模型组小鼠胰腺组织中Ki-67蛋白表达水平显著升高，Bax 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠胰腺组织中Ki-67 蛋白表达水平显著降低，Bax 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；胰岛素组和沙格列汀低剂量组小鼠胰腺组织中Ki-67、Bax 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与胰岛素组、沙格列汀低剂量组相比，沙格列汀高剂量组小鼠胰腺组织中Ki-67 蛋白表达水平显著降低，Bax 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。见图3、表5。

表5 各组小鼠胰腺组织中Ki-67、Bax 蛋白表达水平比较（±s，n=10）Tab.5 Comparison of Ki-67 and Bax protein expression levels in pancreas of mice in each group（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P Ki-67/ GAPDH 0.24±0.040.93±0.151）0.62±0.131）2）0.69±0.121）2）0.44±0.081）2）3）4）54.8790.000 Bax/ GAPDH 0.88±0.140.35±0.051）0.49±0.061）2）0.46±0.061）2）0.67±0.071）2）3）4）63.2310.000

图3 各组小鼠胰腺组织中Ki-67、Bax蛋白表达水情况Fig.3 Expressions of Ki-67 and Bax proteins in pancreas of mice in each group

3 讨论

糖尿病是一种严重的非传染性慢性疾病，是重要的公共卫生问题，分为T1DM、T2DM、妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）及特殊类型糖尿病4个类型。近年来，以儿童青少年为主的T1DM发病率逐年升高，在美国，T1DM 患者高达2500 多万人，相关治疗费用带来的潜在社会、经济负担越来越重[8-11］。目前T1DM 的发病机制尚未完全阐明，多认为是胰岛细胞受到自身免疫系统攻击而减少或损伤，从而导致一系列不可逆的破坏[12］。既往研究治疗对T1DM 胰岛细胞的影响主要集中在胰岛β细胞，针对胰岛α 细胞的研究较少[13］。本研究通过研究沙格列汀对胰岛α细胞增殖、凋亡的影响，以期为T1DM的临床治疗提供新思路。

本研究结果显示，模型组小鼠血糖水平较正常组显著升高，沙格列汀低、高剂量组小鼠血糖水平较模型组显著降低，提示沙格列汀可降低T1DM 小鼠血糖。GLP-1 是胰高血糖素原经剪切后的产物，作用于胰岛β 细胞可促进胰岛素的转录、合成与分泌，刺激胰岛β细胞的增殖和分化并抑制其凋亡，从而增加胰岛β 细胞数量[14-15］。胰高血糖素可促进血糖升高，正常情况下与胰岛素相互拮抗共同维持血糖稳定，胰高血糖素拮抗剂在临床应用中可有效维持血糖稳态、改善β细胞功能，延缓甚至逆转糖尿病病程[16］。王进红等[17］研究发现，沙格列汀可通过阻断GLP-1 降解调节胰岛素分泌，加强机体对葡萄糖的利用及对血糖水平的控制。本研究结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清GLP-1水平显著降低，胰高血糖素水平显著升高；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠血清GLP-1水平显著升高，胰高血糖素水平显著降低，提示T1DM 的发生与GLP-1、胰高血糖素水平有关，沙格列汀治疗T1DM 可能通过影响GLP-1、胰高血糖素实现，与胰岛素作用效果一致，且高剂量沙格列汀治疗效果优于胰岛素。

胰岛α 细胞可通过分泌GLP-1 进而影响胰岛α细胞的增殖及功能，也可通过分泌胰高血糖素加速糖尿病进展[18-19］。本研究结果显示，与正常组相比，模型组小鼠胰岛α 细胞增殖指数显著升高，凋亡指数显著降低；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低、高剂量组小鼠胰岛α细胞增殖指数显著降低，凋亡指数显著升高。Ki-67、Bax分别与细胞增殖、凋亡有关[20］。与正常组相比，模型组小鼠胰岛α 细胞中Ki-67 蛋白水平显著升高，Bax 蛋白水平显著降低；与模型组相比，胰岛素组、沙格列汀低剂量组、沙格列汀高剂量组小鼠胰岛α 细胞中Ki-67 蛋白水平显著降低，Bax 蛋白水平显著升高，提示T1DM 可导致小鼠胰岛α 细胞增殖、凋亡异常，沙格列汀、胰岛素均可通过抑制T1DM 小鼠胰岛α 细胞增殖并诱导其凋亡，推测沙格列汀可能通过影响胰岛α细胞增殖、凋亡进而影响GLP-1、胰高血糖素分泌，最终导致胰岛β细胞功能恢复正常，达到治疗T1DM的目的。

综上所述，沙格列汀可降低T1DM 小鼠血糖水平，可能是通过促进胰岛α细胞凋亡并抑制其增殖，进而促进血清GLP-1 表达，并抑制胰高血糖素表达发挥作用的。