长链非编码RNA在骨关节炎中作用机制的研究进展①

李倩云 肖建辉

（遵义医科大学附属医院医药生物技术研究所，遵义市医药生物技术重点实验室，遵义563003）

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是目前全世界最常见的好发于负重膝关节、髋关节的慢性退行性关节疾病，其特征为进行性软骨退化和丧失、骨赘形成、软骨下骨重建、细胞外基质降解，最终导致关节僵硬、肿胀、疼痛和功能丧失，严重影响老年人的日常生活[1-3］。目前，OA的发病机制尚不明确，研究表明主要与软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成代谢与分解代谢不平衡导致软骨异常重塑有关。根据流行病学数据显示，2017年约有3.03亿人患有骨性关节炎，随着年龄增加男女患病率为1∶1.5，其原因可能与女性激素失调有关。国际骨关节组织指出2020年OA将成为致残的第四大原因[4］。传统的治疗方法包括物理疗法、药物治疗及手术关节置换等，但其效果仅能改善疼痛症状且存在不良反应及术后风险并不能阻断或治愈OA。由于软骨组织缺乏血管、神经、淋巴液的营养支持且软骨细胞属于终末分化细胞，其增殖能力极弱，破坏后难以再生[5-6］，因此，OA的早期发现、早期诊断及早期治疗成为目前极具挑战的新目标。

随着2000年人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）完成，科学家们发现人类基因组30亿碱基中编码蛋白质的DNA比例仅不到2%，但发现了大量非编码序列[7-8］。2012年DNA元件百科全书项目（Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE）完成，证明人基因组中大约有80%的DNA具有功能，而非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）的发现具有里程碑式的作用[9］。其中，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指一类长度大于200个核苷酸多数不编码蛋白质少数能翻译为短肽，存在于细胞核和细胞质中的RNA调控分子，其可在RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ）作用下调控基因表达，包括染色质重构、转录水平调控、转录后修饰等[10-12］。大多数lncRNA保守性差，早期被认为是转录过程中产生的“垃圾”序列，近年来随着研究的不断深入发现lncRNA与心血管疾病、神经系统疾病及肿瘤的发病密切相关，并且日渐成为诊断与治疗的靶点[13-15］。近年来关于lncRNA在OA中的作用机制研究逐渐增多，其可能参与调控ECM蛋白水解降解、抑制软骨细胞凋亡、调节炎症反应、血管生成及自噬等。为了进一步了解其在骨关节炎中的功能，本文就lncRNA的特点及在骨性关节炎发生发展过程中的作用机制予以综述，为骨关节炎的预防及治疗提供理论依据。

1 lncRNA

1.1 lncRNA的分类 lncRNA是继miRNA后的研究热点，迄今为止，lncRNA的分类尚无确切标准，常见的分类方式为与附近编码蛋白质基因的位置不同将lncRNA分为6大类[16］：①反义型lncRNA（anti‐sense，AS），指一类与编码基因反向转录的lncRNA，在哺乳动物中这类lncRNA约占20%，其分布、发育与疾病调控关系密切，起调控附近基因转录的作用，通常加-AS命名，例如：AFAP1-AS1、OIP5-AS1、FAM83H-AS1；②内含子型lncRNA（intronic，IT），指在基因内含子区编码的lncRNA，通常加“-IT”后缀命名，例如：SPRY4-IT1；③重叠转录型lncRNA（overlapping，OT），其编码序列为跨越内含子和外显子的lncRNA，通常用“-OT”后缀命名，例如：OSX2-OT；④长链基因间lncRNA（long intergenic lncRNA，lincRNA），其编码区域位于两基因中间，与任何基因的编码序列均不重叠，通常用“linc”命名，例如：lincRNA-p21、linc00570、linc00485；⑤反义上游双向启动子lncRNA（antisense upstream，Au），指向两个相反方向转录，通常以Au命名，例如：GENE2-Au1；⑥eRNA（enhancer lncRNA），起到促进基因转录的作用（图1）。

图1 lncRNA命名分类Fig.1 Nomenclature of lncRNA

1.2 lncRNA的生物学功能 lncRNA参与调控多种重要的生物学过程，包括染色体沉默、基因组印记以及染色体修饰、转录激活、蛋白质核内运输、调控生物体胚胎发育、组织分化等。根据lncRNA的调控方式分为DNA调控、转录调控、转录后调控、翻译调控、翻译后修饰调控：①DNA调控：在转录前发挥基因调控作用，主要指对染色质开放或关闭状态进行调控。lncRNA可调控组蛋白乙酰化或DNA的甲基化影响转录[17］；②转录调控：对转录过程进行调控，包括：起始、延伸和终止三个过程。对转录因子起到招募（recruitment）和抑制（inhibitor）的作用影响调节转录；③转录后调控：lncRNA可结合mRNA5'端或3'端特定区域影响可变剪切；mRNA加工成熟后需转运到细胞质进行蛋白翻译，lncRNA可影响mRNA的定位；lncRNA可介导mRNA降解，mRNA的丰度直接影响蛋白质的产量；④翻译调控：lncRNA通过结合mRNA的5'-UTR非翻译区促进翻译过程；⑤翻译后修饰调控。值得关注的是2011年，SALMENA等[18］首次提出竞争性内源RNA（com‐peting endogenous RNA，ceRNA）的概念。ceRNA是lncRNA发挥作用的一种新型作用机制，即lncRNA可与miRNA的结合位点竞争性结合，并通过海绵吸附作用于靶基因的3'-UTR区使mRNA稳定表达，这种作用又被称为“miRNA海绵”。

1.3 lncRNA的调控机制 随着对lncRNA的深入研究，发现lncRNA具有信号分子、分子诱导、导向分子及分子支架等生物学功能[19］。①信号分子：lnc-RNA可在不同刺激条件和信号通路下，作为信号传导分子参与信号通路传导。lncRNA作为信号传递分子通过碱基互补配对原则与DNA结合参与调控表达，由于不涉及蛋白质翻译，故对于急性反应可作出更迅速的反应；②分子诱导：lncRNA转录后与靶蛋白（转录因子、染色质修饰蛋白等转录调控因子）结合形成复合体进而调控下游基因转录；③导向分子：指引lncRNA和蛋白结合作用于靶基因，将复合物定位于特定的DNA序列上。研究发现ln‐cRNA介导的这种转录调控作用可为顺式作用模式，也可为反式作用模式；④分子支架：lncRNA可起到“中心平台”的作用，即多个相关转录因子结合在lncRNA分子上，使不同信号通路之间信息交汇和整合，有利于机体对外界信号和刺激产生反馈调节。

2 lncRNA在软骨形成中的作用

目前认为，在软骨形成过程中miRNA、转录因子及信号通路的研究相对较多，而lncRNA的研究仍处于探索阶段，故研究其在软骨形成中的作用尤为重要。软骨分为3种类型：透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。软骨形成是软骨发育的主要过程，软骨发育共包含5个阶段：起始间充质干细胞、软骨细胞、软骨细胞分化、软骨细胞肥大及软骨基质钙化和降解。软骨细胞是软骨中唯一的细胞类型，主要保持滑膜关节的稳态，软骨细胞形成始于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）[20］。间充质干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能且来源广泛的细胞，可参与软骨修复和再生与OA的发生关系密切[21］。PANG等[22］研究表明过表达lncRNA H19后可诱导脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）向软骨细胞分化，并证明lncRNA H19主要通过竞争STAT2的miRNA发挥ADSCs软骨分化过程中的调控作用。研究表明在人滑膜间充质干细胞（human synovial mesenchymal stem cells，hSFMSCs）软骨分化过程中过表达ZBED3-AS1可上调zbed3进而调控Wnt/β-catenin信号传导途径增强软骨形成潜能[23］。HUYNH等[24］发现lncRNA GRASLND可直接作用于SOX9下游，通过与真核起始因子激酶2（EIF2AK2）结合抑制干扰素-γ（IFN-γ）增强软骨形成。近年来，研究发现转录因子SOX4可通过直接结合lncRNA DANCR（分化拮抗非蛋白质编码RNA）的启动子增强SMSCs的增殖和软骨形成，DANCR上调与mRNA直接相互作用激活myc、Smad3和STAT3的表达，并且证明了DANCR、miR‐NA-1305和Smad4之间的串扰在SMSCs增殖和分化中起重要作用[25］。越来越多的研究表明lncRNA可成为软骨治疗的潜在靶标，靶向lncRNA及相关通路可能成为软骨再生的可行方法（表1）。

表1 lncRNA在软骨形成中的作用Tab.1 Role of lncRNA in cartilage formation

3 lncRNA在骨性关节炎中的作用

OA通常表现为软骨关节结构改变，最终导致患者出现关节疼痛、功能障碍和畸形等一系列的临床症状。研究表明OA的发生发展由多种机制介导，主要包括细胞外基质（ECM）降解、软骨细胞凋亡、炎症反应、血管生成和自噬。最近的研究表明，lncRNA与关节软骨紊乱之间存在相关性，这些lnc-RNA差异表达可能为鉴定新的机制和治疗靶标提供新的机会。

3.1 调控ECM蛋白水解的lncRNA关节软骨是由细胞外基质构成的润滑组织，其主要成分为Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖。OA的病理变化表现为细胞外基质合成代谢与分解代谢失衡，基质浓度及比例发生改变。许多酶参与细胞外基质降解退变，其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和解聚素金属蛋白酶（a disintegrin and metal‐loproteinase with thrombospondinmotifs，ADAMTS）是导致软骨ECM降解的主要酶。研究发现，一些lnc-RNA可能通过调控MMP和ADAMTS变化影响软骨细胞表达。LIU等发现lncRNA-CIR可抑制MMP-13和ADAMTS-5的表达，促进OA中Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原和蛋白聚糖的合成代谢，表明其能通过抑制MMP的表达减轻关节软骨损伤。MMP可参与降解软骨组织中糖胺聚糖、层黏连蛋白等多种基质组成成分参与骨关节炎的发展。HOTAIR是一种HOX转录反义基因间反式作用的lncRNA（HOT transcript anti‐sense inter-genic RNA，HOTAIR），通过建立新西兰白兔颞下颌关节IL-1β损伤模型后可显著增加MMP-1、MMP-3和MMP-9的表达，敲除HOTAIR可逆转上述作用并降低ECM分解，进一步研究发现HOTAIR可能是通过wnt/β-catenin途径影响OA[32］。类似的作用机制有lncRNA Nespas，在OA中Nespas不仅可降低Ⅱ型胶原蛋白的表达，而且会显著升高MMP2和MMP13的表达，表明Nespas可能是OA发展的潜在预后生物标志物[33］。在OA软骨细胞中MMP的表达显著高于正常人，并且MMP能显著降低Ⅱ型胶原及糖胺聚糖的表达。有研究发现，H19位于染色体11p15.5鼠7号染色体上长度为2.5 kb，是第一个被发现在胚胎和胎儿整个发育过程中高表达的lncRNA。DUDEK等[34］研究表明H19可通过依赖Y染色体上性别决定区9（sex determining region Y-box 9，SOX9）结合miR-675上调软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达，进而调控软骨细胞表达。在低氧条件下培养软骨细胞检测H19和col2al表达均显著增加，并且表明H19和col2al呈正相关可维持软骨细胞功能。该长链非编码RNA在调节体内合成代谢和分解代谢平衡中具有保护作用[35］。HOX基因对于细胞生长分化和组织发育具有重要的调控作用。综上，H19可在骨性关节炎基质合成与分解中起重要作用。研究发现HOXA远端转录本（HOXA tran‐script at the distal tip，HOTTIP）位于染色体7p15.2上长度为376 nt在HoxA染色体5'端的lncRNA，其在OA软骨细胞中高表达。HOTTIP可通过下调HoxA13及其下游靶标整合素-α1的水平增加软骨破坏[36］，由此可推测HOTTIP通过HOXA-13/整合素-α1/MMP-2轴来促进骨性关节炎转变。

机械应力是骨关节炎中软骨降解发展的重要组成部分。在机械应力作用下，膝盖软骨的lncRNA分析中显示出107种不同的lncRNA在受损软骨中的表达[37］。与机械应力有关的特定胸腺素β-4（TMSB4）被称为lncRNA MSR，在受损软骨中含量较高，并可在机械应力的软骨细胞中被诱导。进一步研究表明过表达lncRNA-MSR显著干扰COL2al和ACAN的表达，并通过ceRNA作用整合miRNA-15加速MMP13和ADAMTS5的表达，有助于软骨降解。

3.2 调节软骨细胞增殖或凋亡的lncRNA细胞凋亡是由受损细胞中半胱氨酸特异性蛋白（胱天蛋白酶）引发程序性死亡，是一种高度特异性调控途径，又称Ⅰ型细胞程序性死亡。凋亡失调将导致癌症、发育异常和退行性疾病等病理状态，也会导致细胞出现萎缩、染色质凝聚、DNA断裂和凋亡小体形成等形态改变。众所周知，凋亡引起软骨细胞数量减少是导致OA的关键因素，通过抑制软骨细胞凋亡可作为治疗OA的潜在靶点[38-39］。多项研究表明lncRNA能参与调控下游途径及蛋白引起软骨细胞凋亡。SONG等[40］发现与正常软骨细胞相比，OA软骨细胞中生长阻滞特异性5（GAS5）与细胞凋亡存在负表达调控，过表达GAS5将刺激软骨细胞凋亡，减少软骨细胞自噬并增加蛋白水解酶表达，例如MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13和AMTS-4等。Wnt/β-catenin信号通路为经典的Wnt信号通路，Wnt作为启动蛋白在OA中会上调促进OA发生发展。研究发现HOX转录反义RNA（HOTAIR）可促进增殖、侵袭和转移来影响骨性关节炎的发展。在兔软骨细胞中敲除HOTAIR可减弱IL-1β诱导后的凋亡率，抑制GAS5或HOTAIR对OA患者具有潜在的治疗意义。进一步研究表明HOTAIR在OA中高表达，通过直接与miRNA-17-5p结合上调FUT2，HOTAIR与FUT2加剧ECM降解和软骨细胞凋亡，而miR-17-5p可通过调节wnt/β-catenin途径促进OA发展，说明HOTAIR可通过Wnt/β-catenin途径对OA起关键作用。另有研究发现lncRNA-CIR通过调节MMP-13从而调节软骨再生。ZHANG等[41］研究表明lncRNA-UFC1可作为细胞活力和软骨细胞增殖的正调节剂，在正常软骨细胞中UFC1水平显著下降，但能促进软骨细胞增殖并抑制软骨细胞凋亡，重要的是他们进一步证明了UFC1主要通过与miRNA-34a结合发挥miRNA海绵作用调节软骨细胞存活。lncRNA-DANCR位于人类4号染色体上，长度为855 bp在肿瘤组织中高表达的长链非编码RNA。研究表明DANCR在软骨细胞中的表达可逆转由miRNA-577调节的SphK2抑制作用，通过miR-577/SphK2轴激活OA软骨细胞增殖并抑制其凋亡[42］。也有研究表明DANCR参与miR-216a-5p/JAK2/STAT3轴调控发挥抗细胞凋亡作用，进而可能成为OA治疗的新靶点。

3.3 调节炎症反应的lncRNA OA一直被认为是非炎症性关节炎。然而，越来越多的证据表明OA进展与炎症有关，研究发现OA患者的滑液和血清中存在炎症介质，表明OA并不是局部的非炎症性病变，多种促炎因子包括IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）可作为OA发生发展的重要驱动因素并导致关节软骨损伤和滑膜关节症状[43-46］。目前研究发现lncRNA有两种途径参与调节OA中的炎症反应，NF-κB信号通路可参与调节多种基因启动子、增强子影响基因转录并在炎症反应中发挥重要作用，当NF-κB激活时可激活多种炎症因子破坏软骨关节。在OA中通过抑制NF-κB信号通路抑制软骨细胞中炎症因子产生。PEARSON等[47］鉴定了两种与软骨细胞炎症相关的linRNA，分别为CILinc01和CILinc02并发现在OA中通过抑制NF-κB活性可增加IL-6、IL-8、TNFα、巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory pro‐tein，MIP-1β）和粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony stimulating factor，G-CSF）的表达对软骨产生保护作用。进一步研究使用NF-κB途径抑制剂IKK1可降低CILinc01和CILinc02表达延迟软骨变性。在OA中期，由于炎症介质不断产生刺激滑膜积液渗出，最终导致骨关节软骨纤维化退变。母系表达基因（materally expressed gene 3，MEG3）是一种位于染色体14q32.2在多种组织中均表达的印记基因。研究表明MEG3在OA中低表达，通过过表达MEG3可明显抑制兔OA模型中IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β的表达，从而控制滑膜积液渗出减少关节软骨改变[48］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是另一种参与细胞炎症反应、增殖、分化且高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通路。lncRNA可通过影响MAPK信号途径影响OA，lncRNA HULC位于6号染色体上长度为500 nt在人类肝细胞癌中发现的第一个lncRNA，研究表明HULC可通过下调miR101抑制NF-κB及MAPK信号通路的激活，从而减轻TNF-α诱导的炎症损伤对软骨起到保护作用，表明HULC可能是骨关节炎中重要的调控因子[49］。OIP5-AS1可通过调节miR-29b-3p/PGRN轴促进OA中软骨细胞的活力和迁移，并抑制炎症反应从而减轻OA中对软骨细胞的损害[50］。

3.4 调节滑膜关节血管生成的lncRNA血管生成是指脉管系统中新生出血管，对生长发育、生殖周期和组织修复起着重要的作用。软骨是一种缺乏血管营养的组织，血管生成是软骨骨化形成的标志与OA发生发展密切相关。尽管调节OA血管生成的确切分子途径尚不清楚，但血管生成受促血管生成和抗血管生成因子调节平衡，其中促血管生成因子包括前列腺素、一氧化氮、调节肽、细胞因子、趋化因子和生长因子，尤其是血管内皮生长因子（vas‐cular endothelial growth factor，VEGF）；抗血管生成因子包括蛋白酶抑制剂、基质片段等[42］。研究发现，软骨细胞中存在与VEGF特异性结合的受体VEGFR-2，当VEGF与VEGFR-2结合后可激活ERK信号通路促进血管新生。VEGF和VEGFR-2是血管生成的重要调控剂，在OA中VEGF表达上调并会降低聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成和表达[51］。研究表明，OA中lncRNA MEG3的水平与VEGF水平呈负相关，敲低MEG3将损害VEGF介导的内皮血管生成，表明MEG3可能通过调节血管生成而参与OA的发展[44］。尽管MEG3对血管生成的机制尚不明确，但有研究表明MEG3可通过激活P53负调控VEGF影响OA。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase ERK1/2）通路可调节细胞生长增殖、分化等生理活动。激活ERK1/2可诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase MMP）活化，活化的MMP能降解软骨基质并对新生血管起密切的调节作用。研究发现lncRNA H19可通过促进ERK调节肥大软骨重塑和血管向生长板软骨侵袭，影响骨性关节炎的发展，因此抑制血管生成为OA的治疗提供了新方法。

3.5 自噬 自噬是一种高度保守的作用机制，是细胞凋亡的一种独特形式，对保护软骨内稳态和细胞存活至关重要，在OA中检测到自噬相关基因（ATG）异常表达及自噬功能障碍，并发现抑制自噬后软骨变性得到缓解。研究表明自噬调节网络中调节软骨涉及PI3K/AKT/mTOR、AMPK、SIRT1、P53途径及一系列相关生长因子、细胞因子和蛋白质。XI等[52］发 现lncHCG18可 激 活miR-146a-5p/TRAF6/NF-κB轴在软骨变性中发挥作用。PC‐GEM1基因是位于染色体2q32位点前列腺特异性lncRNA，可促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制细胞的凋亡。研究表明在滑膜细胞中过表达PCGEM1与miR-770海绵作用促进滑膜细胞增殖并刺激滑膜细胞凋亡（表2）。

表2 lncRNA在骨性关节炎中的作用Tab.2 Role of lncRNA in osteoarthritis

4 芯片及测序预测

随着高通量测序技术（RNA-seq）的发展尤其是全基因组测序等新型测序技术的进步，越来越多的lncRNA在OA中被发现，但大多数lncRNA的功能尚不清楚。通过微阵列分析与正常软骨组织相比，OA中发现121个变化的lncRNA，其中包括HOTAIR、GAS5、PMS2L2、RP11-445H22.4、H19和CTD-2574D22.4等73个上调lncRNA和48个下调的ln‐cRNA[62］。在2019年通过二代测序技术（next gener‐ation sequencing，NGS）研究19个OA患者样本，检测到除TUCP和mRNA外，还存在580种lncRNA改变，并通过蛋白-蛋白互作网络和ceRNA调控网络，确认了4种不同的lncRNA，包括SNHG5、ZFAS1、GAS5和DANCR与OA有关[63］。尽管高通量技术已经筛选出大量差异表达的lncRNA，但仅有其中一部分被研究，其深度及广度还有待进一步研究及探索。就目前研究结果显示，对于lncRNA调控OA的研究仍处在初级阶段，未来可积极结合基因芯片技术、RNA-seq测序技术及生物信息学技术等新型高通量技术，从lncRNA结合mRNA、miRNA、circRNA、蛋白及信号通路水平上综合研究，形成更加全面的网络分析，为日后骨性关节炎的治疗提供理论依据（图2）。

图2 lncRNA在OA中作用机制Fig.2 Mechanism of lncRNA in OA

5 总结与展望

骨性关节炎是常见的慢性关节性疾病，发病机制复杂受一系列危险因素的影响，包括衰老、肥胖、遗传等。目前有学者认为关节软骨损伤的修复程度与损伤类型有关，当软骨损伤直径为1.0～2.0 mm时会产生与正常透明软骨相似的组织，当损伤直径为3 mm以上时又称关节软骨缺损，大多不能完全修复，由纤维软骨再生填补；而当关节软骨损伤直径>6 mm，损伤不但不能修复，还会进一步损伤周围骨壁及周围关节软骨，形成更大的缺损空洞，进而引起损伤周围的软骨下滑及关节软骨的塌陷，造成骨关节炎。

lncRNA的发现使人们对基因调控机制更加了解，lncRNA不仅在转录水平、转录后水平调控基因的表达，而且有研究表明其在基因印记、染色质重塑中也发挥重要作用，由于lncRNA具有高度的表达特异性使其作用机制多样化，目前关于软骨形成及OA发病机制的研究仍处于初步探索阶段，随着对lncRNA在OA的深入研究，明确lncRNA在细胞中的分布，是否涉及上、下游拮抗及协调作用为骨性关节炎的诊断及潜在生物标志物或治疗靶标提供新的希望。