LncRNA DANCR靶向miR-423-5p调控ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡、炎症反应①

李骞 李秀研 林丽丽 许景芬 陈芬

（福建医科大学附属泉州第一医院全科医学科，泉州362000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种由多种危险因素引起的慢性炎症性血管疾病，是全球范围内死亡率和发病率升高的主要原因［1］。内皮细胞在血管功能中发挥重要作用，其功能障碍被认为是AS发生的重要标志。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）是诱导内皮细胞损伤的关键因子，可刺激内皮细胞炎症反应和氧化应激，增加细胞凋亡，破坏细胞功能，进而促进AS发生发展［2］。因此，抑制ox-LDL诱导的内皮细胞损伤对防治AS意义重大。长链非编码RNA（long non-cod‐ing RNA，LncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其通过在转录后、转录和染色质水平上调控基因表达，参与调控内皮细胞功能障碍、胆固醇积聚、炎症等病理过程，与AS进展密切相关［3］。分化拮抗非蛋白编码RNA（differentiation antagonis‐tic non-protein coding RNA，DANCR）是一种肿瘤相关lncRNA，包括肝癌、乳腺癌和肺癌在内的多种恶性肿瘤中DANCR表达失调，其异常表达有助于癌细胞的增殖、迁移和侵袭，是一种潜在的癌症标志物和治疗靶点［4-5］。此外，DANCR还可提高肾小管上皮细胞活力，抑制脂多糖诱导的炎症反应和凋亡［6］。然而，XIST介导AS进展的潜在机制仍不清楚。本研究采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）模拟AS细胞损伤，重点探讨LncRNA DANCR对ox-LDL诱导的HUVEC凋亡和炎症因子分泌的作用，分析其潜在靶基因，以期为AS治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料HUVEC购于中国典型培养物保藏中心；DMEM培养基、胎牛血清购于美国Sigma公司；一步法PCR逆转录试剂盒、微小RNA（microRNA，miRNA）逆转录试剂盒、SYBR Green master Mix购于北京天根生化科技有限公司；miRNA模拟物（miR‐NA mimics）、miRNA抑制物（anti-miR）、过表达载体（pcDNA-RNA）、小干扰RNA（si-RNA）、双荧光素酶报告基因载体由上海生工公司提供；ox-LDL、Trizol试剂、细胞计数试剂盒（cell counting kit 8，CCK-8）、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin VFITC/PI）凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝生物科技公司；细胞周期素D1（CyclinD1）小鼠单克隆抗体、活化型半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）兔单克隆抗体、β-actin兔单克隆抗体、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG购于上海碧云天生物公司；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒购于上海冠导生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC体外损伤模型建立用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于含5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养HUVEC，然后用含50 mg/L ox-LDL的细胞培养液处理细胞24 h构建体外损伤模型，模拟HUVEC AS损伤，记为OX-LDL组，同时设置正常对照（normal control，NC）组［7］。

1.2.2 细胞转染和实验分组将对数期HUVEC接种于6孔板，利用脂质体转染法分别将pcDNA-con、pcDNA-DANCR、anti-miR-con、anti-miR-423-5p、pcD‐NA-DANCR+miR-con、pcDNA-DANCR+miR-423-5p mimics分别转染HUVEC，转染成功后用含50 mg/L ox-LDL的细胞培养液处理细胞24 h，依次命名为ox-LDL+pcDNA-con组、ox-LDL+pcDNA-DANCR组、ox-LDL+anti-miR-con组、ox-LDL+anti-miR-423-5p组、ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-con组、ox-LDL+pcDNADANCR+miR-423-5p组。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测Ln‐cRNA DANCR和miR-423-5p表达按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，测定浓度和纯度后-20℃保存备用。取适量的总RNA，分别使用一步法PCR逆转录试剂盒或miRNA逆转录试剂盒合成cDNA，用SYBR Green master Mix进行RT-qPCR扩增。具体引物如下（5'-3'）：DANCR上游引物CTGCATTCCTGAACCGTTATCT，DANCR下游引物GGGTG‐TAATCCACGTTTCTCAT；β-actin上游引物CCAACCGCGAGAAGATGA，β-actin下游引物CCAGAGGC‐GTACAGGGATAG；miR-423-5p上游引物ATGGTTC‐GTGGGTGA，miR-423-5p下 游 引 物GTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，U6下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。2-ΔΔCt法计算LncRNA DANCR（内参为β-actin）和miR-423-5p（内参为U6）相对表达量。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力收集各组细胞，按照100 μl/孔、5×103个/孔接种于96孔板，24 h后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，培养箱继续孵育2.5 h，酶标仪检测450 nm波长处每孔的吸光度（A）值。细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组细胞，结合缓冲液调整为1×108个/L的单细胞悬液。取100 μl细胞悬液，按照Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒分别加入Annexin V-FITC和PI，室温条件下暗室孵育15 min，补加结合缓冲液至总体积为500 μl，流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.6 Western blot检 测CyclinD1、Cleaved-cas‐pase-3蛋白表达水平放射免疫沉淀缓冲液提取各组细胞的总蛋白。蛋白定量后取适量蛋白和等体积上样缓冲液混合，煮沸5 min使蛋白变性冷却至室温后备用。按照每泳道30 μg蛋白上样，100 V 90 min进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。快速蛋白湿转移将蛋白转移至硝酸纤维素膜后，用含5%脱脂奶粉的封闭液室温孵育2 h。用稀释的CyclinD1抗体（1∶200）、Cleaved-caspase-3抗体（1∶1 000）、β-actin抗体（1∶1 000）溶液孵育室温孵育膜2 h。用稀释的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG溶液（1∶1 000）室温孵育膜1 h。用化学发光显色试剂盒进行显影。曝光后，Image J1.8.0软件检测每个条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白β-actin灰度值比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验将含有miR-423-5p结合位点的LncRNA DANCR野生（WT）序列或突变（MUT）序列克隆到双荧光素酶报告质粒，构建双荧光素酶报告基因载体WT-LncRNA DANCR、MUT-LncRNA DANCR。利用脂质体转染法将WTLncRNA DANCR、MUT-LncRNA DANCR分 别 与miR-con或miR-423-5p mimics共 转 染 至HUVEC，48 h后检测细胞相对荧光素酶活性。同时将pc-DNA-con、pcDNA-DANCR、si-con、si-DANCR分别转染HUVEC，48 h后RT-qPCR检测miR-423-5p表达水平。

1.2.8 ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α分 泌水平收集各组细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书步骤分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.3 统计学分析每组设置3个平行实验，重复3次，所有计量资料符合正态分布，用±s表示。采用SPSS22.0软件进行统计学分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组件多重比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ox-LDL处理HUVEC中LncRNA DANCR、miR-423-5p的表达情况与NC组比较，ox-LDL组HU‐VEC中LncRNA DANCR的表达水平显著降低，miR-423-5p表达水平显著升高（P<0.05）。见表1。

表1 HUVEC中LncRNA DANCR和miR-423-5p表 达 量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of LncRNA DANCR and miR-423-5p in HUVEC（±s，n=9）

表1 HUVEC中LncRNA DANCR和miR-423-5p表 达 量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of LncRNA DANCR and miR-423-5p in HUVEC（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P<0.05.

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2.2 过表达DANCR对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响与NC组比较，ox-LDL组HUVEC中LncRNA DANCR表达显著降低，细胞存活率、Cy‐clinD1蛋白表达显著降低，细胞凋亡率、Cleaved-cas‐pase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）；与ox-LDL+pcDNA-con组比较，ox-LDL+pcDNA-DANCR组HU‐VEC中LncRNA DANCR表达显著升高，细胞存活率、CyclinD1蛋白表达显著升高，细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.05）。见图1、表2。

表2 过表达DANCR对ox-LDL诱导的HUVEC细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC cells（±s，n=9）

表2 过表达DANCR对ox-LDL诱导的HUVEC细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P<0.05；compared with ox-LDL+pcDNA-con，2）P<0.05.

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图1 过表达DANCR对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响Fig.1 Effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC

2.3 抑 制miR-423-5p对ox-LDL诱导 的HUVEC增殖和凋亡的影响与ox-LDL+anti-miR-con组比较，ox-LDL+anti-miR-423-5p组HUVEC中miR-423-5p表达显著降低，细胞存活率、CyclinD1蛋白表达显著升高，细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.05）。见表3、图2。

图2 抑制miR-423-5p表达对ox-LDL诱导的HUVEC细胞增殖和凋亡的影响Fig.2 Effect of miR-423-5p inhibition on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC cells

表3 抑制miR-423-5p表达对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-423-5p inhibition on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC（±s，n=9）

表3 抑制miR-423-5p表达对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-423-5p inhibition on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC（±s，n=9）

Note：Compared with ox-LDL+anti-miR-con，1）P<0.05.

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2.4 LncRNA DANCR靶向miR-423-5p LncRNA DANCR与miR-423-5p之间存在特异性互补结合位点，见图3。与miR-con和WT-LncRNA DANCR共转染比较，miR-423-5p mimics和WT-LncRNA DANCR共转染后HUVEC相对荧光素酶活性显著降低（P<0.05）；与miR-con和MUT-LncRNA DANCR共转染比较，miR-423-5p mimics和MUT-LncRNA DANCR共转染后HUVEC相对荧光素酶活性无显著变化，见表4。pcDNA-DANCR组HUVEC中miR-423-5p表达显著低于pcDNA-con组（P<0.05）；si-DANCR组HUVEC中miR-423-5p表达显著高于si-con组（P<0.05），见表5。

表4 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P<0.05.

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表5 RT-qPCR检测miR-423-5p的表达（±s）Tab.5 RT-qPCR detects expressions of miR-423-5p（±s）

表5 RT-qPCR检测miR-423-5p的表达（±s）Tab.5 RT-qPCR detects expressions of miR-423-5p（±s）

Note：Compared with pcDNA-con，1）P<0.05；compared with si-con，2）P<0.05.

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图3 miR-423-5p和LncRNA DANCR结合预测示意图Fig.3 Schematic diagram of miR-423-5p and LncRNA DANCR binding prediction

2.5 过表达miR-423-5p可以逆转DANCR过表达对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响与ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-con组 比较，ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-423-5p组HUVEC中miR-423-5p表达显著升高，细胞存活率、CyclinD1蛋白表达显著降低，细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）。见表6、图4。

表6 过表达miR-423-5p可以逆转DANCR过表达对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 miR-423-5p overexpression can reverse effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDLinduced HUVEC（±s，n=9）

表6 过表达miR-423-5p可以逆转DANCR过表达对ox-LDL诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 miR-423-5p overexpression can reverse effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDLinduced HUVEC（±s，n=9）

Note：Compared with ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-con，1）P<0.05.

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图4 过表达miR-423-5p可以逆转DANCR过表达对ox-LDL诱导的HUVEC细胞增殖和凋亡的影响Fig.4 miR-423-5p overexpression can reverse effect of DANCR overexpression on proliferation and apop⁃tosis of ox-LDL-induced HUVEC cells

2.6 ELISA检测各组炎症因子分泌水平与NC组比较，ox-LDL组HUVEC上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05）；与ox-LDL组比较，ox-LDL+pcDNA-DANCR组、ox-LDL+anti-miR-423-5p组HU‐VEC上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低（P<0.05）；与ox-LDL+pcDNA-DANCR组相比，ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-423-5p组HUVEC上 清 中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05）。见表7。

表7 ELISA检测各组炎症因子分泌水平（±s，n=9）Tab.7 ELISA detects secretion levels of inflammatory factors in each group（±s，n=9）

表7 ELISA检测各组炎症因子分泌水平（±s，n=9）Tab.7 ELISA detects secretion levels of inflammatory factors in each group（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P<0.05；compared with ox-LDL，2）P<0.05；compared with ox-LDL+pcDNA-DANCR，3）P<0.05.

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3 讨论

AS是冠心病和脑卒中的主要病理基础，是心血管疾病发生的主要原因。内皮细胞损伤及其功能障碍在AS的发展中起着至关重要的作用，探讨与内皮细胞损伤相关的基因，分析其作用机制，有望为AS治疗提供新的策略。

LncRNA DANCR在缺氧诱导的大鼠心肌细胞中表达降低，LncRNA DANCR高表达通过上调缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）表达减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤［8］。LncRNA DANCR高表达可增强糖氧剥夺处理的脑微血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，对改善缺血性脑卒中具有重要意义［9］。本研究结果表明，ox-LDL处理HU‐VEC后，细胞存活率显著降低，凋亡率显著升高，Lnc-RNA DANCR表达量显著降低。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌是参与AS的发病机制的重要因素［10-11］。本研究显示，ox-LDL诱导后HUVEC上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，提示LncRNA DANCR低表达可能与ox-LDL诱导的HUVEC损伤有关。CyclinD1是一种重要的周期蛋白，磷脂酰肌醇激酶抑制剂BYL719通过下调CyclinD1表达可诱导HUVEC阻滞于G1期，抑制细胞增殖［12］。Cas‐pase-3是细胞凋亡发展中最关键的执行分子，其活化是检测细胞凋亡的重要指标［13］。进一步转染DANCR过表达载体上调LncRNA DANCR表达发现，ox-LDL诱导的HUVEC存活率、CyclinD1升高，凋亡率、Cleaved-caspase-3表达降低，IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，说明过表达LncRNA DANCR能够改善ox-LDL诱导的HUVEC炎症反应和凋亡。

miRNA为非编码RNA家族重要成员，研究显示，miRNA通过与LncRNA相互作用参与调解氧化应激、细胞凋亡和炎症反应等多种细胞过程［14-16］。为探索LncRNA DANCR作用机制，本研究发现miR-423-5p是其潜在靶基因。研究表明缺氧诱导的心肌细胞中miR-423-5p表达增加，miR-423-5p高表达导致线粒体膜电位的丢失、活性氧生成增加，促进心肌细胞凋亡［17］。在急性肾损伤后，miR-423-5p通过诱导内质网络应激和氧化应激，抑制肾小管上皮细胞的修复［18］。此外，LncRNA RPSAP52通过靶向下调miR-423-5p能够抑制缺氧诱导的肾近端小管上皮细胞凋亡［19］。本研究显示，ox-LDL诱导后HU‐VEC中miR-423-5p表达显著升高，抑制miR-423-5p表达可提高HUVEC存活率，减轻ox-LDL诱导的HUVEC凋亡、炎症因子分泌，与过表达LncRNA DANCR作用一致。进一步研究证实，LncRNA DANCR对miR-423-5p具有靶向负调控作用，且过表达miR-423-5p能够逆转LncRNA DANCR对ox-LDL处理的HUVEC炎症因子分泌、存活、凋亡以及相关蛋白表达的影响，说明LncRNA DANCR可提高靶向miR-423-5p减轻ox-LDL诱导的HUVEC炎症反应和凋亡。

综上所述，ox-LDL引起HUVEC中LncRNA DANCR表达降低，过表达LncRNA DANCR通过靶向下调miR-423-5p可促进HUVEC存活，改善ox-LDL诱导的HUVEC炎症反应和凋亡，为基于HUVEC损伤的AS治疗提供了新的方向。