基于Nrf2/ARE信号通路探讨辛伐他汀减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的作用

钱 斌 尹小川 李小军 陈 蔚 张 敏（昆明医科大学第一附属医院药剂科，昆明650032）

多种因素（如肺炎、机械暴击、吸入有毒有害气 体等）引发的急性肺损伤（acute lung injury，ALI）导致肺泡上皮和肺部毛细血管内皮细胞异常凋亡是患者呼吸困难、低氧血症等肺功能障碍的主要原因，如不能有效控制症状，将演变为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）甚至休克、多器官功能障碍（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）或 衰 竭（multiple organ failure，MODF）［1-2］。临床常用药物如地塞米松会加大ALI老年患者医源性类固醇糖尿病风险，因此拓宽ALI用药选择具有重要意义。CHAMBERS等［3］指出，内皮组织异常细胞凋亡导致组织结构受损是ALI患者的主要病理学改变。高聪等［4］研究表明，抑制肺组织细胞凋亡可明显改善ALI大鼠肺损伤。XU等［5］研究表明，大量无法及时清除的活性氧（reactive ox‐ygen species，ROS）是导致ALI大鼠肺组织内皮细胞凋亡的关键因子。信号通路核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）是机体内最重要的内源性抗氧化通路。研究证明，Nrf2/ARE通过调控抗氧化酶如血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及转运蛋白谷胱甘肽（glutathione，GSH）等表达清除细胞内ROS，抑制氧化应激，降低细胞凋亡率［6］。辛伐他汀作为一线调控血脂药物，对心脏、动脉等有良好的保护作用。临床研究发现，辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）合并肺动脉高压具有良好疗效，但辛伐他汀对ALI的作用研究鲜有报道［7］。本研究通过建立大鼠ALI模型，探讨Nrf2/ARE对ALI大鼠肺组织的保护作用，为辛伐他汀临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级8~10周龄SD雄性大鼠40只，体重200~220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0011，按照我院实验动物管理办法，室温下标准饲料、自由饮水、分笼（4笼）适应性饲养1周后用于后续实验。本研究经我院实验动物管理伦理委员会批准（2019-032）。

1.1.2 主要试剂与仪器辛伐他汀（20 mg，杭州默沙东制药有限公司）；脂多糖（LPS，10 mg/只，Sigma公司，生产批号：L2880）；地塞米松（dexamethasone，DXMS，0.75 mg，广东华南药业集团有限公司）；Nrf2、HO-1抗体、兔抗磷酸GAPDH抗体（美国Santa公司）；Western blot试剂盒（德国Rebstock公司）；TUNEL染色试剂盒、DCFH-DA染色试剂盒（南京建成生物有限公司）；HE染色试剂盒（上海碧云天公司）；蛋白浓度测定试剂盒、DAB化学发光试剂盒（北京华夏远洋科技有限公司）；LIOOS600T生物显微镜（日本尼康公司）；Bio-Rad凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；-80℃冰箱（德国维根斯公司）；Leica RM2135组织切片机（德国Leica公司）；高速低温离心机（北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 模型构建和分组处理适应性喂养1周后，将大鼠随机分为4组：正常组、模型组、辛伐他汀干预组（实验组）、阳性对照药地塞米松干预组（DXMS组），每组10只。实验组、DXMS组大鼠分别腹腔注射1 ml辛伐他汀溶液（5 mg/kg）和1 ml DXMS溶液（5 mg/kg），正常组、模型组分别腹腔注射等量生理盐水；腹腔注射30 min后，模型组、实验组、DXMS组大鼠分别尾静脉注射0.5 ml LPS（5 mg/kg）复制ALI模型［8］，正常组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。

1.2.2 肺组织湿重/干重（W/D）测定注射完毕后，所有大鼠正常饮食，自由饮水喂养4 h后断头处死大鼠，打开胸腔无菌取出其肺组织，肉眼观察各组大鼠肺组织解剖病理变化；无菌清洗，无菌吸水纱布吸干，取各组大鼠肺组织（左肺下叶除外）-80℃备用。同时取各组大鼠左肺下叶，清洗血迹，称重（湿重W），60℃连续烘干48 h，称重（干重D），计算W/D。

1.2.3 HE染色观察各组大鼠肺组织病理学改变准确称取50%各组大鼠左肺上叶组织，10%甲醛固定24 h，切片，HE染色，光镜下观察病理改变，根据肺泡内细胞浸润、肺泡出血、肺泡间隔水肿及肺泡内纤维蛋白沉积4个方面进行评价，每只大鼠取4张切片，各切片选取6个不同视野进行评分，取平均值。评分标准：无病变或轻微病变记为0分；轻度病变记为1分；中度病变记为2分；重度病变记为3分；极重度病变记为4分［9］。由病理研究室2位经验丰富的医师分别对肺泡、肺泡腔、肺泡壁及肺部出血情况进行评分，各项评分总值即为大鼠肺组织的ALI总评分。

1.2.4 TUNEL染色检测各组大鼠肺组织细胞凋亡取50%各组大鼠右中肺组织，常规方法固定，冰冻切片，二甲苯浸洗2次，梯度乙醇浸洗5 min，风干，3%过氧化氢-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，3 min/次，4℃预冷乙醇下操作：0.1%TritonX-100、0.1%缓冲液处理2 min，PBS漂洗3次，3 min/次，加入TUNNEL反应混合液，加入封口膜暗湿盒中37℃反应1 h，PBS漂洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，荧光显微镜下观察，每组切片选取6个不同视野，Image-Pro 6.2软件处理图像，统计分析细胞凋亡率。

1.2.5 DCFH-DA染色检测ROS含量评估各组大鼠肺组织氧化应激反应取50%各组大鼠右中肺组织，10%多聚甲醛固定2 h，石蜡包埋，切片，10 μmol/L DCFH-DA染色2 h，荧光显微镜下拍照，随机选取5个不重复区图像，Image J1.41分析绿色荧光平均强度值，依次对每组样本进行统计分析。按照各试剂盒说明书要求，采用MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒检测肺组织中与氧化反应相关底物变化。

1.2.6 qRT-PCR检测各组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、SOD和MDA基因表达准确称取50%各组大鼠左肺上叶组织，加入细胞裂解液，常规提取总RNA，测定浓度［10］，以逆转录试剂盒为模板合成单链cDNA，PCR仪测量。各样品设3个平行复孔，独立测量3次。引物序列见表1。

表1 目的基因序列Tab.1 Sequence of target genes

1.2.7 免疫组化检测各组大鼠肺组织Nrf2和HO-1表达取50%各组大鼠右下肺组织，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，二甲苯和梯度乙醇脱蜡，缓冲液中修复2 h充分暴露抗原决定簇。3%过氧化氢浸泡，室温孵育10 min，封闭，PBS冲洗3次，分别加入稀释好的一抗4℃孵育过夜，次日冲洗干净，分别加入适量生物素标记的二抗室温孵育30 min，清洗，DAB显色2~5 min至显微镜下观察到棕黄色颗粒，去离子水终止反应（DAB显色剂现用现配，避光保存）［11］。苏木素轻度复染1.5~2 min，清洗，梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡，干燥，中性树胶封片，显微镜下观察并记录，分析图像。

1.2.8 Western blot检测各组大鼠肺组织Nrf2和HO-1表达取50%各组大鼠右下肺组织，加入组织裂解液裂解，冰浴5 min，离心，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度［12］，凝胶电泳分离蛋白，转PVDF膜，5%TBST液中室温封闭2 h，加入一抗稀释液（1∶1 000）4℃反应过夜，次日冲洗干净，加入二抗（1∶10 000）室温孵育，ECL显色，以GAPDH为内参，E-Gel Imager凝胶成像仪检测，计算目的蛋白相对表达。

1.3 统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用Graphpad5.01软件作图，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织W/D比较与正常组大鼠相比，模型组大鼠肺组织W/D明显升高（P<0.05），与模型组相比，实验组、DXMS组大鼠肺组织W/D明显降低（P<0.05），实验组和DXMS组差异无统计学意义（P>0.05，图1）。

图1 各组大鼠肺组织W/DFig.1 W/D of lung tissue of rats in each group

2.2 各组大鼠肺组织解剖学及病理学比较正常组大鼠肺组织表面光滑、饱满富有弹性，呈粉红色，肺组织表面无出血点，无斑点，被膜无紧张，切面无渗出，模型组大鼠肺组织表面皱缩严重，呈红褐色，取出肺组织时有泡沫样黏液流出，肺组织明显肿大，肺组织表面有片状淤血，出血点较多，同时被膜明显僵硬，切面有渗出，实验组、DXMS组大鼠肺组织较模型组有明显好转，虽见水肿，但出血点和淤血区域明显减少（图2A）。HE染色结果显示，正常组大鼠肺组织结构完整，无充血、扩张及出血现象，肺泡腔结构清晰，肺泡壁厚度均匀，无增宽、渗出等现象，肺泡间隔及各级支气管管腔内均未见水肿、炎症细胞浸润、分泌物渗出等。和正常组相比，模型组大鼠肺组织肺泡腔明显变小，厚度不均一，间隔明显增宽，腔内大量炎症细胞填充，肺泡壁充血严重，支气管及周围毛细血管存在大量炎症细胞浸润，管腔有渗出血细胞、炎症细胞和其他分泌物填充，ALI病理评分明显升高（P<0.05），实验组、DXMS组大鼠肺组织病理症状有所缓解，肺泡大小均一，腔内少量水肿液填充，炎症细胞明显减少，肺泡周围毛细血管基本无扩张、充血现象，ALI病理评分明显降低（P<0.05），实验组和DXMS组差异无统计学意义（P>0.05，图2B）。

图2 各组肺组织解剖学及病理学变化Fig.2 Anatomical changes and pathology changes of lung tissue in each group

2.3 TUNEL染色检测各组大鼠肺组织细胞凋亡TUNEL染色结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织细胞凋亡率明显升高（P<0.05），与模型组相比，药物干预后，实验组、DXMS组大鼠肺组织细胞凋亡率明显降低（P<0.05），实验组和DXMS组差异无统计学意义（P>0.05，图3）。

图3 各组大鼠肺组织细胞凋亡情况Fig.3 Cell apoptosis of lung tissue of rats in each group

2.4 DCFH-DA染色检测ROS含量评估各组大鼠肺组织氧化应激反应DCFH-DA染色结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织绿色荧光强度明显增强，ROS含量明显增多（P<0.05），与模型组相比，药物干预后，实验组、DXMS组大鼠肺组织绿色荧光强度明显减弱，ROS含量明显降低（P<0.05）；采用试剂盒检测氧化应激反应相关底物和酶活性，结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织细胞MDA含量明显增加，而SOD酶活性明显降低（P<0.05）；与模型组相比，药物干预后，实验组、DXMS组大鼠肺组织细胞MDA含量明显降低，SOD酶活性明显增强（P<0.05）；实验组和DXMS组差异无统计学意义（P>0.05，图4）。

图4 各组大鼠肺组织氧化应激比较Fig.4 Comparison of oxidative stress in lung tissue of rats in each group

2.5 qRT-PCR检测各组大鼠肺组织中Nrf2、HO-1、SOD和MDA基因表达qRT-PCR结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、MDA mRNA表达明显升高（P<0.05），SOD mRNA表达明显降低（P<0.05）；与模型组相比，实验组和DXMS组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、SOD mRNA表达明显升高（P<0.05），MDA mRNA表达明显降低（P<0.05）；实验组和DXMS组差异无统计学意义（P>0.05，图5）。

图5 各组大鼠肺组织中Nrf2、HO-1、SOD、MDA mRNA表达Fig.5 Nrf2，HO-1，SOD，MDA mRNA expressions in lung tissue of rats in each group

2.6 免疫组化及Western blot检测各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1表达免疫组化及Western blot结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织Nrf2和HO-1表达明显升高（P<0.05），与模型组相比，实验组和DXMS组大鼠肺组织Nrf2和HO-1表达明显升高（P<0.05），实验组和DXMS组差异无统计学意义（P>0.05，图6）。

图6 各组肺组织中Nrf2、HO-1表达Fig.6 Nrf2 and HO-1 expressions in lung tissue of rats in each group

3 讨论

革兰氏阴性菌LPS主要成分内毒素引发的机体感染中，肺脏是主要靶器官，ALI是最常见的肺损伤症状，其病理症状为肺部毛细内皮细胞大量凋亡导致血管通透性增强，ROS过度生成，氧化应激异常活跃，导致肺间质和肺泡水肿，肺组织结构破坏严重，呼吸窘迫等，如未及时缓解，可能危及患者生命［12］。因此需要寻找有效手段以控制ALI时的氧化应激，及时清除聚集的ROS，抑制肺组织细胞凋亡，保障ALI患者生命安全。

常用药物地塞米松对ALI伴有心力衰竭、高血压等心脏疾病的老年患者疗效有限，且可能增加患者医源性类固醇性糖尿病风险。作为一线降血脂药物，辛伐他汀在心血管疾病临床治疗中，患者耐受性好，不良反应较轻微且呈一过性。研究表明，辛伐他汀可明显抑制炎症因子释放，抑制血小板聚集，发挥抗凝血、改善血管内皮功能、抗氧化和免疫调节等作用［13］。SOHN等［14］研究证实，辛伐他汀可有效抑制氧化应激，在缺血性脊髓损伤动物模型中抑制细胞异常凋亡。MEDEIROS等［15］研究发现，辛伐他汀对脓毒症引起细胞凋亡导致的小鼠休克疗效较好。宋海刚等［16］研究发现，长期服用辛伐他汀可明显减轻由机械通气引发的氧化-抗氧化失衡，减轻呼吸机相关性肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）小鼠肺组织损伤。JIANG等［17］研究证明，改变辛伐他汀剂型可明显增强辛伐他汀对ALI的治疗效果。本研究通过构建ALI大鼠模型，发现与模型组相比，实验组大鼠ALI肺组织病理特征明显改善，肺组织细胞凋亡率明显降低，证明了辛伐他汀对ALI的治疗作用。

Nrf2/ARE是机体内最重要的内源性抗氧化信号通路。Nrf2是心血管系统、肾、肝、肺等组织中广泛存在的一种调控因子，正常生理状态下，Nrf2通过氢键与伴侣分子耦合以复合物形式在细胞质中稳定存在，细胞氧化应激时，氢键断裂，大量Nrf2游离，与ARE结合，诱导靶基因增强HO-1等抗氧化酶表达，清除ROS，进行抗氧化应激，维持细胞正常结构［18］。研究显示，多种呼吸系统疾病如急慢性肺损伤、COPD、肺纤维化等中，Nrf2/ARE通路发挥重要保护作用［19］。LONDON JR等［20］研究表明，Nrf-2基因缺失可减少抗氧化酶，导致小鼠感染多种肺疾病。陆元兰等［21］研究证实，Nrf2在百草枯致大鼠急性肺损伤中发挥保护作用。本研究检测各组大鼠氧化应激结果发现，与模型组相比，实验组大鼠肺组织中ROS、MDA含量明显降低，SOD活性明显增强，氧化应激明显受阻，而免疫组化及Western blot检测结果显示，实验组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1表达较模型组显著提高，推测辛伐他汀可能通过激活Nrf2/ARE通路发挥作用。

综上所述，辛伐他汀可保护ALI大鼠肺组织，可能通过激活Nrf2/ARE通路，增强Nrf2和HO-1表达，抗氧化，抑制细胞凋亡实现，但其是否通过其他通路影响ALI进程需进一步研究。