葛根素通过抑制ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡通路活化稳定AS易损斑块①

章平衡 李春燕 刘永源 王明 刘锦鸿 梁东辉（南方医科大学珠江医院，广州510282）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）易损斑块是急性心血管疾病发生的重要病理基础。近年研究发现，细胞焦亡和炎症在AS易损斑块进展过程中起关键作用。巨噬细胞是AS易损斑块形成的重要推动者［1-2］。AS斑块中包含大量泡沫化的巨噬细胞，在疾病发展过程中，胆固醇被巨噬细胞吞噬并在细胞中沉积，形成泡沫化细胞，同时促进巨噬细胞分泌大量炎症细胞因子，如IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，加重局部炎症反应，进而促进巨噬细胞焦亡，从而释放大量炎症细胞因子，如IL-1、IL-18等，加重AS易损斑块炎症反应，导致斑块进一步损伤和破裂，促进急性心血管疾病发生发展［3-5］。

目前，临床治疗AS及稳定斑块的药物主要为他汀类药物，虽然可有效降低血脂水平，抑制脂蛋白和胆固醇合成和分泌，稳定易损斑块，但作用靶点单一，具有多种副作用，如肝功能受损、肌肉酸痛、皮疹等，临床应用受限，无法满足所有患者需求［4］。近年药理学研究发现，中药葛根的有效成分葛根素具有抗炎、调脂降压、保护心肌细胞、抗血小板聚集、调节免疫、增强心肌收缩力、扩张冠状动脉等功效［5-6］。新近研究表明，葛根素具有抗AS、降低AS炎症因子作用，但具体机制尚未阐明［7］。因此，本研究通过观察葛根素对体外ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响，以NLRP3介导的细胞焦亡信号通路为靶点，探讨葛根素稳定AS易损斑块、抗AS和预防急性心血管疾病的潜在分子机制，为临床稳定AS易损斑块和防治急性心血管疾病提供新思路和治疗药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂THP-1细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司；葛根素（C21H20O9，分子量416.38）购自北京索莱宝生物科技有限公司（0.1 g）；RP‐MI1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司；佛波酯（PMA）、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒购自北京全式金公司；NLRP3（货号：SH-bs-10021R）、Caspase-1（货号：22915-1-AP）、cleaved-Caspase-1（货号：4199S）抗体购自美国Abcam公司；GAPDH购自武汉三鹰生物技术有限公司；DAB显色液购自广州赛国生物公司；聚合HRP标记IgG（抗鼠货号：RM3001，抗兔货号：RM3002）二抗购自武汉博士德公司；RIPA裂解液购自江苏凯基生物技术股份有限公司；细胞总RNA抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.1.2 主要仪器荧光显微镜购自日本Nikon公司；制冰机购自意大利Scotsman公司；恒温浴箱购自上海跃进医疗器械一厂；超纯水机购自美国Mil Upore公司；高皮灭菌锅购自英国Astell公司；离心机、移液枪、微量移液器购自德国Eppendorf公司；实时荧光定量PCR仪、-80℃冰箱购自德国Thermo公司；-20℃冰箱、4℃冰箱购自德国Siemens公司；细胞CO2培养箱购自美国Thermo Scientific公司；核酸微量分光光度计购自美国NanoVue公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；超净工作台购自苏州安泰。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组采用RPMI1640培养液（含5%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 μg/ml链霉素）培养THP-1细胞，取对数生长期细胞以1×106个/孔接种于6孔板，加入PMA，37℃、5%CO2培养48 h诱导巨噬细胞，进行后续实验。实验分为5组：对照组（仅加入RPMI1640培养液）、ox-LDL组（加入RP‐MI1640培养液和100 μg/ml ox-LDL）、葛根素低、中、高剂量组［加入RPMI1640培养液和100 μg/ml ox-LDL的同时分别加入100、250、500 μg/ml葛根素（CCK-8实验确定）］，培养48 h后进行后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活率将处理好的巨噬细胞以1×105个/孔接种于96孔板，培养24 h，分别加入100 μg/ml ox-LDL及葛根素（50、100、250、500、1 000 μg/ml），各组设3个复孔。对照组仅加入100 μg/ml ox-LDL，培养48 h，分别加入CCK-8试剂（10 μl/孔），避光混匀，放置4 h，采用酶标仪检测波长490 nm处OD值，确定葛根素有效的高、中、低剂量进行后续实验。

1.2.3 油红O染色将巨噬细胞以1×105个/孔接种于24孔板，分别采用100 μg/ml ox-LDL和高、中、低剂量葛根素进行处理，培养48 h，弃培养基，4%多聚甲醛固定10 min，蒸馏水洗涤2次，60%异丙醇浸泡5 min，加入新配制的油红O染液浸染30 min，弃染色液，蒸馏水洗涤3次。加入苏木染液复染细胞核1~2 min，弃染色液，清洗3次，油镜下观察脂质情况，300 μl异丙醇（1 000 ml/L）脱色10 min，520 nm处测定吸光度（A）值进行脂质定量。

1.2.4 RT-qPCR检测巨噬细胞中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α mRNA水平收集处理后的各组巨噬细胞，按说明书提取巨噬细胞总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR进 行 目 的 基 因 扩 增。PCR扩 增 体 系：2×TB Green 10.0 μl，引物各0.4 μl（引物序列见表1），50×ROX ReferenceDyeⅡ0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl，总体系20 μl。反应条件：95℃预变性30 s，95℃退火5 s，60℃延伸34 s，共40个循环，95℃延伸15 s。以actin为内参，2-ΔΔCt计算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 免疫荧光检测炎症小体NLRP3水平将巨噬细胞以1×105个/孔接种于24孔板，给予相应药物处理，取各组细胞爬片，4%多聚甲醛（500 μl/孔）固定30 min，PBS清洗3次，5 min/次，0.5% Triton X-100（500 μl/孔）透膜30 min，5%BSA封闭30 min，加入NLRP3稀释液（1∶200，250 μl/孔）4℃过夜，PBS清洗3次，5 min/次，加入cy3标记的二抗（1∶500，250 μl/孔）室温避光孵育2 h，PBS清洗3次，5 min/次，加入250 μl含10 μg/ml DAPI的PBS染核30 min，PBS清洗3次，5 min/次，荧光显微镜下观察。

1.2.6 Western blot检测细胞焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1水平收集各组巨噬细胞，加入RIPA裂解液裂解30 min，4℃离心，取上清。BCA法测定蛋白浓度，取10 μg总蛋白，进行SDS-PAGE分离，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶于0.5%TBST配制封闭液，室温作用2 h，加入NLRP3一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶1 000）、cleaved-Caspase-1一抗（1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶2 000）4℃孵育过夜，TBST漂洗滤膜3次，5 min/次，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次，ECL法显影曝光，AlphaEase FC软件分析显影带，目的蛋白表达=OD目的蛋白/ODGAPDH。

1.3 统计学分析采用SPSS22.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）及LSD检测，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞光学显微镜下可观察到未经过PMA诱导分化THP-1单核细胞呈透亮圆形和类圆形状态，加入PMA诱导分化24 h后则分化为巨噬细胞，多呈不规则、梭形或有伪足状态（图1）。

图1 THP-1单核/巨噬细胞形态（×100）Fig.1 Morphology of THP-1 monocytes/macrophages（×100）

2.2 不同浓度葛根素对巨噬细胞存活率的影响不同浓度葛根素（50、100、250、500、1 000 μg/ml）对ox-LDL诱导的巨噬细胞均有不同程度保护作用。48 h时，葛根素浓度为100、250、500 μg/ml时巨噬细胞存活率最高（P<0.01），且保护效果呈剂量依赖性（图2）。因此，后续实验确定100、250、500 μg/ml为葛根素低、中、高干预剂量。

图2 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞存活率的影响Fig.2 Effects of puerarin on survival rate of macrophages induced by ox-LDL

2.3 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞内脂质聚集的影响采用高、中、低剂量葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞进行干预，油红O染色结果显示，未经ox-LDL处理的巨噬细胞内几乎无脂质沉积或仅有微量脂质（图3红色部分），经ox-LDL处理的巨噬细胞内可见大量脂质沉积，簇集成环状，几乎充满整个胞浆，细胞体积明显增大，呈泡沫样改变，葛根素处理ox-LDL诱导的巨噬细胞后，细胞内脂质明显减少，且呈剂量依赖性，细胞体积相对缩小（图3）。

图3 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞内脂质聚集的影响（×400）Fig.3 Effect of puerarin on lipid accumulation in macro⁃phages induced by ox-LDL（×400）

2.4 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症细胞因子的影响RT-qPCR检测葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症细胞因子水平，结果显示，与空白对照组相比，ox-LDL诱导的巨噬细胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平明显升高（P<0.01），与ox-LDL组相比，葛根素处理后巨噬细胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平明显降低（P<0.01），且呈剂量依赖性（图4）。

图4 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症细胞因子的影响Fig.4 Effect of puerarin on inflammatory cytokines of macrophages induced by ox-LDL

2.5 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡蛋白的影响免疫荧光检测葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症小体NLRP3表达，Western blot检测焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1水平，结果显示，与空白对照组相比，ox-LDL诱导的巨噬细胞中焦亡蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-1水平明显升高（P<0.05），与ox-LDL组相比，葛根素处理后巨噬细胞中焦亡蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-1水平明显降低（P<0.05，P<0.01），且呈剂量依赖性（图5、6）。

图5 葛根素对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡相关蛋白的影响Fig.5 Effect of puerarin on pyroptosis related proteins in macrophages induced by ox-LDL

图6 巨噬细胞内NLRP3荧光强度（×200）Fig.6 Fluorescence intensity of NLRP3 in macrophages（×200）

3 讨论

AS是心血管疾病的重要病理基础，而AS易损斑块则是急性心血管疾病发生的重要因素，亦是导致患者高死亡率的原因之一。巨噬细胞则是AS易损斑块形成和发展的重要参与者［8］。炎症刺激作用下，趋化血液中的单核细胞聚集并浸润至血管内膜下，在其所处的炎症微环境作用下进一步分化为巨噬细胞［9-10］。高脂环境中，巨噬细胞吞噬其微环境中的ox-LDL和胆固醇结晶，加上机体自身清除能力有限，导致巨噬细胞内脂质大量沉积，进而发生泡沫化，细胞体积增大，在血管局部形成脂质池，促进AS斑块形成［11-12］。本研究在体外采用PMA诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞，ox-LDL诱导巨噬细胞建立细胞模型，结果发现巨噬细胞在ox-LDL作用下细胞内脂质含量明显增加，细胞体积明显增大，大量细胞发生泡沫化改变，而采用葛根素干预后，巨噬细胞中脂质含量明显下降，细胞体积缩小，泡沫化细胞数明显减少，且呈剂量依赖性改变。体外细胞实验研究表明，葛根素可抑制巨噬细胞活化，清除巨噬细胞内脂质，减少巨噬细胞炎症因子分泌［13-14］。

AS易损斑块形成除受巨噬细胞泡沫化改变的影响外，还与其局部活跃的炎症密切相关。但巨噬细胞内脂质大量聚集情况下，这些不能被及时清除的脂质又可诱导巨噬细胞内细胞焦亡信号通路活化，导致巨噬细胞焦亡，进而释放大量炎症细胞因子，在局部促进易损斑块形成。研究证明，ox-LDL可上调巨噬细胞中Caspase-1和炎症小体NLRP3水平，并通过激活Caspase-1信号通路促进巨噬细胞中IL-1β、TNFα和IL-2等炎症细胞因子分泌［15-16］。巨噬细胞中还含有与细胞焦亡相关的NLRP3受体和NLRP3炎症小体。一项研究通过沉默NLRP3受体，发现NLRP3炎症小体表达明显降低，并进一步通过小干扰RNA干扰NLRP3基因表达，发现ox-LDL诱导的巨噬细胞IL-1β分泌明显减少［17］；另有研究表明，胆固醇晶体可促进人巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化，加速AS发展［18］；以上研究均证明巨噬细胞内脂质聚集可通过激活NLRP3信号通路，促进炎症因子分泌，导致AS发生发展。因此，ox-LDL和胆固醇晶体激活的NLRP3炎症小体可能是促进AS炎症形成的关键因素。另有多项研究表明，巨噬细胞焦亡与AS斑块不稳定密切相关［19-20］。三酰甘油体外处理巨噬细胞后，可检测到cleaved-Caspase-1水平明显上升，且出现细胞焦亡［21］。ox-LDL作用下，人巨噬细胞中NLRP3依赖的Caspase-1通路发生活化，进而促进巨噬细胞裂解、炎症因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α大量分泌［20］。本研究通过ox-LDL体外诱导巨噬细胞，发现巨噬细胞内焦亡蛋白NLRP3和cleaved-Caspase-1水平明显升高，且巨噬细胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α mRNA水平明显升高。葛根素干预后，ox-LDL诱导的巨噬细胞中焦亡蛋白NLRP3和cleaved-Caspase-1水平明显降低，且巨噬细胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α mRNA水平明显降低，且呈浓度依赖性，提示葛根素分别从转录和蛋白水平阻止巨噬细胞焦亡发生。

综上，葛根素作为中药葛根的有效成分，可有效抑制oxLDL诱导的巨噬细胞NLRP3/Caspase-1信号通路活化，抑制IL-2、IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子表达，从而抑制巨噬细胞焦亡，发挥抗炎和抗AS作用。细胞焦亡及其释放的大量炎症细胞因子在AS易损斑块形成、脱落及破裂等进程中起关键作用，葛根素可靶向抑制NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路活化，减少炎症细胞因子产生，起效更快，为心脑血管疾病临床治疗提供了潜在靶点，为其临床治疗提供了新方法和依据。但葛根素对心血管的保护作用及分子机制仍需进一步研究。