天麻素通过抑制TLR4/ASK1信号减轻脓毒症小鼠的肺脏炎症

俞江灏， 周金山， 蒋晓宁， 黄俊超， 顾海波， 陈思洋

(浙江大学医学院附属第四医院，浙江 义乌 322000)

脓毒症是引发呼吸窘迫综合征的最常见因素[1-2]，急性呼吸窘迫综合征是严重全身性炎症6～48 h内的一种严重性继发性疾病[1]。在急性呼吸窘迫综合征中，血浆炎性细胞因子的基线水平与潮气量和疾病严重程度及死亡风险呈现显著的相关性[2]。脓毒症引起的呼吸窘迫综合征与其他原因导致的呼吸窘迫综合征相比，前者的发病率和死亡率高达60%[3-4]。目前脓毒症及呼吸窘迫综合征的仍是对症治疗，最常用的是抗菌治疗和抗炎治疗，包括使用抗生素[5]和糖皮质激素[6-7]。减轻潜在的全身感染风险或减轻肺脏炎症可减少或减轻脓毒症继发性的急性呼吸窘迫综合征发生和发展。这需要进一步研究脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征的发病机制和新疗法。

天麻是传统名贵中药，天麻素是从中药天麻中提取的酚类葡萄糖苷，又称天麻苷[8]。目前，关于天麻素的研究主要集中于心脑血管相关的疾病上[8-9]，包括抗抑郁、抗脑缺血、抗心绞痛、抗动脉粥样硬化等作用。有研究显示，天麻素可以显著降小鼠和大鼠全身血液中炎症因子的水平[10-11]，提示其具有较强的全身性抗炎作用。LPS增多是脓毒症导致全是炎症的主要原因之一[12]。卢志杰研究[13]显示，天麻素可以显著降低脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的炎症，如TNF-α和IL-1β。这提示天麻素可能通过减轻全身炎症治疗脓毒症相关急性肺损伤。目前，国内外尚无将天麻素应用于脓毒症的相关研究，也无将天麻素应用于脓毒症肺脏急性损伤的相关研究。本研究中，我们初步探究了天麻素对盲肠穿刺致小鼠脓毒症急性肺损伤的炎症的影响，并初步研究了TLR4/ASK1信号是否参与了天麻素对脓毒症急性肺损伤的小鼠治疗作用。

1 材料

70只SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2014-0001，饲养于浙江大学实验动物中心。天麻素(批号190806)购于成都植标化纯生物计数有限公司。IL-1β、IL-6、TNF-α小鼠ELSIA检测试剂盒购于武汉伊艾博科技有限公司；苏木素伊红染色液购于北京索莱宝科技有限公司；Anti-TLR4兔多克隆抗体(ab13556)、Anti-ASK1兔多克隆抗体(ab131506)、Anti-ASK1(phospho S83)兔多克隆抗体(ab47304)、Anti-beta Actin兔多克隆抗体(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L-HRP(ab6721)购于英国Abcam公司。2235石蜡切片机、EG1150石蜡包埋机(德国莱卡公司)；Axio Imager 2显微镜(德国蔡司公司)；iMARK酶标仪、1645070电泳电源、Mini-PROTEAN垂直电泳槽、GelDoc XR+凝胶成像系统(美国伯乐公司)。

2 方法

2.1 脓毒症小鼠模型的建立、分组及给药 使用盲肠穿刺手术复制小鼠脓毒症模型，将小鼠适应性饲养3 d后，1%戊巴比妥钠0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉小鼠。打开小鼠腹腔下部，暴露盲肠。在距离盲肠远端1.5 cm处，使用手术缝合线结扎盲肠。将结扎后的末段盲肠，使用22号无菌针刺穿。之后将盲肠放回腹腔，缝合小鼠腹腔。假手术小鼠麻醉后打开腹腔，不进行盲肠结扎和穿刺操作。完成手术后，各小鼠腹腔注射1 mL 37 ℃预热的生理盐水。

70只雄性C57BL/6小鼠，随机取10只进行假手术，剩余60只进行盲肠穿刺手术。小鼠分为假手术组(n=10)、模型组(n=15)、天麻素250 mg/kg组(n=15)、天麻素50 mg/kg组(n=15)和天麻素10 mg/kg组(n=15)。各剂量天麻素组中的小鼠腹腔注射给药5次，注射时间分别为术后0、6、12、18、24 h，假手术组和模型组小鼠腹腔注射等容积生理盐水。给药结束后，假手术组小鼠未死亡，模型组和各剂量天麻素组中的小鼠存活≥10只，小鼠死亡率约为1/3。取模型组和各剂量天麻素组中的10只小鼠进行实验。

2.2 脓毒症小鼠样本的采集 术后24 h给药1 h后，各小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.1 mL/10 g)麻醉,通过颈部总动脉血管收集血液。处死小鼠后打开胸腔，手术缝合线结扎双侧肺部，1 mL注射器将0.5 mL预冷(4 ℃)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)通过气管注入至肺内，可见肺脏膨胀变大，回抽注射器收集肺泡灌洗液，重复3次灌洗后，收集约1.5 mL的肺泡灌洗液。将小鼠血液和灌洗液离心，收集血清和肺泡灌洗液的上清液，用于炎症因子的检测；取小鼠右肺固定于4%多聚甲醛中，用于病理组织学和免疫组织化学的检测；左肺冰冻保存，用于蛋白印迹的检测。

2.3 脓毒症小鼠血清及肺泡灌洗液炎症因子的检测 使用小鼠源ELISA试剂盒检测各组小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6及TNF-α炎症因子水平，按照说明说稀释各试剂盒的标准品，将血清和肺泡关系液加入至包被抗体的96孔板并孵育后，丢弃孔中液体，清洗5次后，加入显色底物，显色30 min后，加入终止液终止反应，使用酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度值。拟合标准曲线获得浓度与吸光度值的相关性方程式，计算待测样本的各炎症因子水平。

2.4 脓毒症小鼠肺脏HE染色 取4%多聚甲醛固定的小鼠肺脏组织，切块、脱水、透明、浸蜡后制成蜡块，切片机切成5 μm薄片，进行脱蜡和复水，苏木素染色3 min后，自来水冲洗。以1%盐酸酒精分化20 s，自来水流水浸泡冲洗20 min，使小鼠肺脏切片充分返蓝。伊红染色1 min后蒸馏水清洗1次，梯度乙醇(80%、90%、95%、100%)进行脱水，二甲苯浸泡10 min，中性树胶封片。使用带有拍照功能的光学显微镜对小鼠肺脏切片组织进行观察并拍照,炎性浸润评分标准为几乎不可见0分，轻度炎性浸润1分，中度炎性浸润3分，重度炎性浸润5分。

2.5 脓毒症小鼠肺脏免疫组化染色 按“2.4”项下操作步骤将小鼠肺脏切成5 μm薄片，进行脱蜡和复水，3% H2O2浸泡切片10 min，以灭活小鼠肺脏中的内源性过氧化物酶；使用抗原修复液浸泡小鼠肺脏切片，以修复组织中的抗原，之后使用PBS清洗小鼠肺脏切片3次。Anti-TLR4兔多克隆抗体(ab13556)和Anti-ASK1(phospho S83)兔多克隆抗体(ab47304)按1∶100比例稀释后覆盖肺脏组织，于4 ℃过夜。使用PBS清洗肺脏组织3次后，用1∶200稀释后的山羊抗兔IgG H&L-HRP(ab6721)抗体孵育小鼠肺脏2 h，再次清洗3次后，使用DAB显色试剂盒孵育切片至阳性表达部位变黄，清洗后苏木素染色3 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化20 s，自来水流水浸泡冲洗20 min，使小鼠肺脏切片充分返蓝，梯度乙醇(80%、90%、95%、100%)进行脱水，二甲苯浸泡10 min后，使用中性树胶封片，显微镜观察组织并拍照。

2.6 脓毒症小鼠肺脏组织蛋白印迹 精确称取小鼠肺脏组织，每50 mg肺脏中加入1 mL含有PMSF和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液，充分研磨后于4 ℃裂解2 h，12 000 r/min离心10 min后取上清液。使用BCA蛋白定量检测试剂盒测定各样本的蛋白浓度，向剩余的上清液中加入蛋白上样缓冲液并煮沸，制备SDS-PAGE凝胶，使用微凉上样器，将含有50 μg总蛋白的样本加入至样本孔中，电泳分离蛋白，分离后将蛋白转移至PVDF膜上。室温下用5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜1 h，然后与β-actin(1∶3 000)、TLR4(1∶1 000)、ASK1(1∶1 000)或p-ASK1(1∶1 000)的一抗在4 ℃环境下孵育过夜，将PVDF膜清洗后，用1∶10 000稀释后的山羊抗兔IgG H&L-HRP(ab6721)抗体孵育1 h。清洗3次后，使用化学发光试剂在凝胶成像系统中拍照。

3 结果

3.1 天麻素降低脓毒症小鼠血清及肺泡灌洗液体中IL-1β、IL-6及TNF-α水平 与假手术组比较，模型组小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；与模型组比较，250、50 mg/kg天麻素干预后三者水平降低(P<0.01)，见图1。

注：与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-1β(A、D)、IL-6(B、E)、TNF-α(C、F)水平(n=10)

3.2 天麻素改善脓毒症小鼠肺脏中的炎症浸润 HE染色结果显示，模型组小鼠肺脏中肺泡壁充血、肺泡细胞边界不清及炎细胞浸润明显，250、50、10 mg/kg天麻素干预后，均可降低小鼠肺脏中的充血及炎细胞浸润情况；与假手术组比较，模型组小鼠炎症浸润评分升高(P<0.01)，10、50、250 mg/kg天麻素干预后，小鼠肺脏组织炎症浸润评分降低(P<0.05)，见图2。

注：比例尺50 μm。与假手术组比较，##P<0.01与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 小鼠肺脏HE染色及炎症浸润评分(n=10)

3.3 天麻素抑制脓毒症小鼠肺脏中TLR4及p-ASK1表达 免疫组织化学染色与蛋白印迹的结果均显示，与假手术组比较，脓毒症模型小鼠肺脏中TLR4及p-ASK1的蛋白表达水平升高(P<0.01)；与模型组比较，天麻素250、50、10 mg/kg治疗干预可降低脓毒症模型小鼠肺脏中TLR4及p-ASK1的表达水平(P<0.01)，见图3。

注：A和B分别为小鼠肺脏TLR4免疫组化染色及其定量，比例尺50 μm；C和D分别为小鼠肺脏p-ASK1免疫组化染色及其定量，比例尺50 μm；E和F分别为TLR4、ASK1、p-ASK1蛋白印迹及其定量。与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 小鼠肺脏中TLR4及p-ASK1表达(n=6)

4 讨论

全身性的炎症是导致脓毒症所致呼吸窘迫综合征发展致死的主要原因[14]。因此炎症的抑制对治疗脓毒症急性肺损伤有着极为重要的意义。抗菌治疗是治疗脓毒症急性肺损伤的首要必须治疗手段[14]，有研究提示，感染的一个小时内给予抗生素治疗可以有效减少严重脓毒症和脓毒症性休克患者的死亡率[15]。但是抗生素的治疗，在很多情况下并未显示出对严重性全身炎症较好的抑制作用，往往需要联合抗炎治疗，如联合使用糖皮质激素[16]。虽然小型研究表明皮质激素对急性呼吸窘迫综合征患者有益，但日本最新的一样研究显示，皮质激素类的高使用率与呼吸窘迫综合征的高死亡率成正相关[17]。因此，皮质激素类在呼吸窘迫综合征时的应用仍需谨慎，目前仍迫切需要研究能够缓解炎症并保护肺脏组织的药物，以治疗该类疾病。

目前尚无研究提示天麻素对脓毒症小鼠的有益作用，但本研究显示，中药天麻提取物天麻素对脓毒症急性肺损伤小鼠的全身炎症和肺胀炎症具有显著的抑制作用，可以显著降低盲肠穿刺小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6及TNF-α水平，同时减轻盲肠穿刺致脓毒症小鼠肺脏中的炎性细胞浸润，减轻肺脏的损伤。结果提示，天麻素对脓毒症可能具备治疗作用。

Toll样受体4(TLR4)可通过与脂多糖(LPS)结合来鉴定外源病原体，刺激抗菌肽的产生并诱导非特异性免疫反应，在脓毒症时LPS在体内大量增加，过度激活TLR4刺激全身性炎症因子的产生[18]。Zhou等[19]研究显示TLR4/MyD88信号通路的抑制对脓毒症相关急性呼吸窘迫综合征的有益作用，包括改善肺脏组织的炎症、抑制肺脏组织的破坏及降低外周血中IL-1β及TNF-α。有很多中药或中药单体将TLR4作为肺炎治疗药物的潜在靶点，如莲沁解毒汤被发现可降低LPS诱导的炎性细胞因子表达和肺损伤，并阻断肺组织中TLR4/NF-κBp65信号的激活[20]，黄芪和丹参通过调节TLR4/NF-κB信号产生对LPS诱导的肺部炎症的保护和治疗作用[21]，鱼腥草提取物鱼腥草素钠可显著减轻LPS诱导的肺部炎症[22]。本研究发现，中药天麻提取物天麻素，通过抑制TLR4的表达，降低了脓毒症急性肺损小鼠模型全身和肺脏中的炎症因子，并减轻肺脏的损伤。

凋亡信号调节激酶1(ASK1)是一种进化保守的丝裂原活化蛋白3-激酶，可同时激活JNK和p38丝裂原活化蛋白激酶[23]。ASK1是诱导TLR4依赖性促炎细胞因子所必需的[23]，是内毒素血症时通过TLR4产生促炎性细胞因子的关键决定因素[24]。Mizumurak等[25]研究显示，LPS诱导正常人肺微血管内皮细胞中，ASK1的磷酸化显著增加，沉默ASK1的表达显著减轻肺微血管中组织因子的表达。本研究观察了天麻素对脓毒症急性肺损伤小鼠模型肺胀中ASK1和p-ASK1表达的变化，结果显示，天麻素可以显著降低模型小鼠肺脏中p-ASK1的表达。综上所述，本研究提示，天麻素能够显著抑制盲肠穿刺致小鼠脓毒症模型的肺脏炎症，其作用机制可能与抑制TLR4/ASK1信号有关。