离子液体辅助提取牡丹皮中丹皮酚工艺的优化

唐一梅， 秦 蓓*， 张德柱， 王 锦

(1.西安医学院药学院药物研究所，陕西 西安 710021；2.陕西盘龙药业集团股份有限公司，陕西 西安 710025)

丹皮酚具有抑菌抗炎[1-2]、抗肿瘤[3-5]、增强免疫功能[6]等作用，在国际市场上售价较高。虽然我国丹皮资源丰富，但传统提取工艺存在提取损失大、提取成本高等不足[7]，导致资源浪费。

离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的熔融盐[8]，具有热稳定性好、蒸气压低、溶解能力强等优点[9-17]，已用于有机合成[10-11]、电化学[12]、生物工程[13]、萃取技术[14-17]等领域。另外，离子液体结构的可设计性也可用于天然产物活性成分的提取与分离[18-19]。

本实验研究了水蒸气蒸馏法、回流法，不同溶剂体系及离子液体加入方式、种类、浓度对丹皮酚提取率的影响，发现[RMIM]Br-水体系回流(煎煮)时丹皮酚提取率最高；离子液体-水-水蒸气蒸馏法能够获得大量挥发油，但丹皮酚含量极低，并且水蒸气蒸馏法不能获得此结果。与传统提取工艺相比，离子液体辅助提取牡丹皮中丹皮酚、挥发油具有操作简单、节约资源、节约能源等优点[7]，值得工业化推广。

1 材料

1.1 试剂与药物 1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br)、1-甲基-3-己基咪唑溴([HMIM]Br)、1-甲基-3-辛基咪唑溴离子液体([OMIM]Br)均为自制。丹皮酚对照品(批号Y27F7Y17002，上海源叶生物科技有限公司)。牡丹皮(市售)经西安医学院药学院生药教研室张彦老师鉴定为芍药科植物牡丹PaeouiaSuffruicoatAndr.的干燥根皮。六氟磷酸钾(分析纯，萨恩化学技术有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2 仪器 LC-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)；SB-5200DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 牡丹皮中丹皮酚的提取

2.1.1 水蒸气蒸馏法 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加10倍量水超声处理15 min，加热蒸馏，收集馏出液，冷却至室温，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，滤过，25 ℃下干燥称重，即得丹皮酚晶体。取3份药材，同法提取3次，即得提取物晶体。

2.1.2 水-NaCl水蒸气蒸馏法

2.1.2.1 不同加盐量 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加10倍量水，再分别加入0、0.5、0.75、1.0、1.25 g NaCl超声处理15 min，加热蒸馏，收集馏出液，冷却至室温，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，洗涤，滤过，25 ℃下干燥称重，即得提取物晶体。每种方法各称取3份药材，同法提取3次。

2.1.2.2 不同浸泡时间 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加10倍量水，在加入0.75 g NaCl分别浸泡1、2 h后超声处理15 min，加热蒸馏，收集馏出液，冷却至室温，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，洗涤，滤过，25 ℃下干燥称重，即得提取物晶体。每种方法各称取3份药材，平行提取3次。

2.1.3 水-离子液体水蒸气蒸馏法 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，按液料比10∶1进行提取(离子液体与水比例1∶9)，精密量取5.00 mL[OMIM]Br至圆底烧瓶中，先浸泡30 min，再加45 mL蒸馏水超声处理15 min，加热蒸馏提取，馏出液于4 ℃冰箱中冷藏24 h，同法操作3次，即得离子液体浸泡后加水、水-离子液体浸泡后的油状提取物。

2.1.4 水体系回流 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，按液料比10∶1进行提取，超声处理15 min，加热回流提取2次，每次1 h，合并滤液，于水浴锅上浓缩至适量。

2.1.5 [RMIM]Br-water体系回流

2.1.5.1 不同离子液体种类 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，按液料比10∶1进行提取(离子液体与水比例1∶9)，精密量取5.00 mL[RMIM]Br(R=butyl、hexyl、hexyl)至圆底烧瓶中，浸泡30 min，再加45 mL蒸馏水超声处理15 min，加热回流提取2次，每次1 h，合并滤液，于水浴锅上浓缩至适量。

2.1.5.2 不同离子液体浓度的选择 取药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，液料比为10∶1，分别按离子液体与水比例1∶15、1∶12、1∶6、1∶3进行提取，精密量取不同体积[OMIM]Br至圆底烧瓶中，浸泡30 min后加入不同体积蒸馏水超声处理15 min，再加热回流提取2次，每次1 h，合并滤液，于水浴锅上浓缩至适量。

2.2 溶液制备和色谱条件

2.2.1 对照品溶液 精密称取丹皮酚对照品10.12 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 [RMIM]Br-water体系按[RMIM]Br与KPF6比例1∶1加入KPF6，乙酸乙酯反复洗涤，收集乙酸乙酯层，除去溶剂后甲醇定容至25 mL量瓶中，分别精密吸取1.00 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.2.3 色谱条件 Agilent HC-ODS (2)色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相甲醇-水(60∶40)；体积流量1 mL/min；检测波长274 nm；进样量10 μL。

2.3 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.2.3”项色谱条件下各进样10 μL测定。以吸光度为纵坐标(A)，丹皮酚质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=35.794X+241.30(r=0.999 1)，在20.44 ～408.8 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4 丹皮酚含量测定 根据2020版《中国药典》附录《药品质量标准分析方法验证指导原则》要求，采用外标法测定丹皮酚含量。

2.4.1 水蒸气蒸馏法 水蒸气蒸馏得到的丹皮酚晶体熔点为49.8 ℃，而文献报道其范围在49～51 ℃之间，故本实验所得为纯品。浸泡时间为0、1、2 h 时，丹皮酚质量分别为63.10、44.40、42.0 mg，即不浸泡时效果最佳，见图1。

图1 NaCl加入量对丹皮酚提取量的影响Fig.1 Effect of NaCl addition on the extraction amount of paeonol

2.4.2 水-离子液体水蒸气蒸馏法 取5 g药材，离子液体浸泡后分别加水、水-离子液体浸泡，水蒸气蒸馏法得油状提取物，平行3次，得油状物。

2.4.3 水-离子液体体系回流法 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液10.0 μL，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，结果见图2，丹皮酚提取量见图3。

图2 不同溶剂体系中丹皮酚色谱图Fig.2 Chromatograms of paeonol in differentsolvent systems

图3 离子液体种类对丹皮酚提取量的影响Fig.3 Effect of ionic liquid type on the extraction amount of paeonol

2.4.4 不同浓度离子液体体系回流法 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液10.0 μL，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，结果见图4，丹皮酚提取量见图5。

图4 不同浓度离子液体中丹皮酚色谱图Fig.4 Chromatograms of paeonol in different concentrations of ionic liquids

图5 离子液体浓度对丹皮酚提取量的影响Fig.5 Effect of ionic liquid concentration on the extraction amount of paeonol

3 讨论与结论

由图1可知，NaCl-水蒸气蒸馏法提取时最优工艺为5 g药材加入15%NaCl、10倍量蒸馏水，不浸泡直接超声处理15 min，表明NaCl的存在可减弱丹皮酚在水中的溶解度，易于结晶析出。由图2、4可知，HPLC法对丹皮酚提取结果进行实时检测时，能快速获得不同溶剂体系、不同浓度离子液体体系对丹皮酚提取率的影响。由图3可知，选择1-辛基-3-甲基咪唑溴([OMIM]Br)作为离子液体时丹皮酚提取率最高。另外，由于[RMIM]Br离子液体随着烷基链长的增长疏水性增加，故在疏水性成分丹皮酚的物质传递过程中，[OMIM]Br传质能力强于[HMIM]Br、[BMIM]Br。

在水蒸气蒸馏提取过程中，[OMIM]Br浸泡后加水时油状提取物质量为946.7 mg，而[OMIM]Br-水浸泡油状物的质量为688.3 mg。经HPLC法分析发现，该油状提取物中丹皮酚含量很低，也低于传统水蒸气蒸馏提取，其原因可能为离子液体有破坏细胞壁和纤维素的能力，有利于挥发油释放，但加水稀释后上述作用减弱，导致其含量降低。

在离子液体-水-水蒸气蒸馏法提取丹皮酚过程中，大量油状物被馏出，并且冷藏静置后无结晶析出。经HPLC法分析发现，挥发油中丹皮酚含量很低，其原因可能为离子液体破坏了细胞壁和纤维素[20]，使得挥发油易于释放的同时包覆了丹皮酚，抑制了该成分迁移与释放[21]。

离子液体的加入可破除细胞壁，溶解纤维素，释放活性成分；与活性成分之间存在一定的相互作用力而有利于传质，使后者迁移到溶剂体系中；破坏细胞壁和纤维素，使丹皮酚更好地迁移。但离子液体加到一定量时提取体系黏度增加，反过来会抑制丹皮酚迁移，故其加入量应有限度，具体有待继续研究。

丹皮酚最佳提取工艺是采用回流(煎煮)提取，离子液体[OMIM]Br，离子液体与水比例1∶3，液料比10∶1，提取2次，KPF6除去残留离子液体，提取液萃取剂乙酸乙酯。与传统提取方法比较，离子液体加入量少，易于去除，污染小；丹皮酚提取率高，操作方法简单，易于工业化；得到了水蒸气蒸馏法不能获得的大量挥发油，有利于节约牡丹皮资源。