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小儿解表口服液HPLC特征图谱建立及4种成分测定

2021-09-24解盈盈翟士旭林永强

中成药 2021年9期
关键词:号峰牛蒡葛根素

汪 冰, 解盈盈, 薛 菲, 翟士旭, 林永强*

(1.山东省食品药品检验研究院,山东省中药标准创新与质量评价工程实验室,山东 济南 250101;2.威海人生药业集团股份有限公司,山东 济南 250022)

小儿解表口服液由金银花、葛根、牛蒡子、黄芩、连翘、蒲公英、紫苏叶等药材经提取而成,具有宣肺解表,清热解毒之功效,临床主要用于治疗小儿外感风热引起的恶寒发热、头痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛痒[1-4]。该制剂现行质量控制标准主要是连翘苷、黄芩苷、葛根素的TLC定性鉴别和金银花中绿原酸定量测定[5],虽然在一定程度上保障了产品质量,但无法全面反映其质量状况。因此,本实验建立小儿解表口服液HPLC特征图谱,并对隐绿原酸、葛根素、黄芩苷、牛蒡苷含量进行测定,以期从整体上评价该制剂质量[6-15]。

1 材料

Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司,配置二极管阵列检测器、Empower 2色谱工作站);CP225D电子分析天平(德国赛多利斯公司);Milli-Q 超纯水系统(美国默克密理博公司);KQ-500DB型数控超声波清洗器(功率500 W,昆山市超声仪器有限公司)。小儿解表口服液13批,购自威海人生药业集团股份有限公司,批号分别为20161201(S1)、20161202(S2)、20161203(S3)、0190101(S4)、0190102(S5)、0190103(S6)、0190104(S7)、0190201(S8)、0190202(S9)、0190203(S10)、0190301(S11)、0190302(S12)、0190303(S13)。

绿原酸(批号110753-201314,纯度96.6%)、黄芩苷(批号110715-201117,纯度91.7%)、葛根素(批号110752-201313,纯度95.5%)、连翘苷(批号110821-201615,纯度94.9%)、牛蒡苷(批号110819-200606)、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸(批号111894-201102)、咖啡酸(批号110885-200102)对照品均购自中国食品药品检定研究院;隐绿原酸对照品(批号MUST-19032403,纯度99.07%)购自成都普思生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为Millipore纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-0.4%磷酸(B),梯度洗脱(0~10 min,10%A;10~35 min,10%~25%A;35~40 min,25%~35%A;40~43 min,35%A);体积流量1.0 mL/min;柱温35 ℃;检测波长230 nm;进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量,50%甲醇制成每1 mL分别含绿原酸45.24 μg、隐绿原酸33.00 μg、咖啡酸5.04 μg、葛根素20.38 μg、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸41.56 μg、黄芩苷97.03 μg、连翘苷14.80 μg、牛蒡苷69.63 μg的溶液,即得。

2.2.2 对照药材溶液 取蒲公英、金银花、紫苏叶、葛根、黄芩、连翘、牛蒡子对照药材各0.1 g,25 mL 50%甲醇超声处理30 min,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3 供试品溶液 精密量取口服液2 mL,置于50 mL量瓶中,50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按制剂处方和工艺,分别制备缺蒲公英、缺金银花、缺葛根、缺黄芩、缺连翘、缺牛蒡子、缺紫苏叶阴性样品,按“2.2.3”项下方法制备,即得。

2.3 特征图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品(S1),按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定6次,所得色谱图中1~8号峰以绿原酸为参照,9~13号峰以黄芩苷为参照,测得13个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别小于0.5%、1.0%,表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取样品(S1),按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,所得色谱图中1~8号峰以绿原酸为参照,9~13号峰以黄芩苷为参照,测得13个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均分别小于0.5%、1.5%,表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取样品(S1),按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”项色谱条件下进样测定,所得色谱图中1~8号峰以绿原酸为参照,9~13号峰以黄芩苷为参照,测得13个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均分别小于0.5%、1.0%,表明溶液在25 h内稳定性良好。

2.4 图谱生成 按“2.2.3”项下方法制备13批样品的供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)对其色谱图进行分析(图1),选择重复性、分离度较好,可归属到处方药味的13个色谱峰作为共有峰。由于共有峰在图谱中主要分布于前后部分,较为分散,故以保留时间适中、峰面积较大、分离度较好的2号峰(绿原酸)、10号峰(黄芩苷)为参照,保留时间在25 min前的1~8号峰选择前者,25 min后的9~13号峰选择后者,计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见表1~2。

图1 13批样品HPLC特征图谱Fig.1 Characteristic HPLC chromatograms of thirteen batches of samples

表1 共有峰相对保留时间

表2 共有峰相对峰面积

2.5 共有峰相对保留时间规定值确定 以绿原酸为参照峰1,计算前8个共有峰的相对保留时间;以黄芩苷为参照峰2,计算后5个共有峰的相对保留时间。以13批样品HPLC特征图谱中13个共有峰的相对保留时间平均值为规定值,分别为0.93(峰1)、1.00(峰2)、1.15(峰3)、1.40(峰4)、1.50(峰5)、1.86(峰6)、1.94(峰7)、2.32(峰8)、0.87(峰9)、1.00(峰10)、1.04(峰11)、1.07(峰12)、1.16(峰13),并且偏差均应在±5%以内。由表2可知,8个共有峰相对峰面积RSD较大(>10%),故只规定共有峰相对保留时间,而不规定其相对峰面积。

2.6 共有峰指认及归属 通过与对照药材溶液、阴性样品溶液色谱峰进行比较,可判定1号色谱峰来自蒲公英,2号色谱峰为金银花、蒲公英、牛蒡子的共有峰,3号色谱峰来自金银花,4号色谱峰为蒲公英、紫苏叶的共有峰,5~8号色谱峰来自葛根,9号色谱峰为金银花、蒲公英的共有峰,10、13号色谱峰来自黄芩,11号色谱峰来自连翘,12号色谱峰来自牛蒡子。再进行对照品定位及紫外光谱比较,确定峰2为绿原酸,峰3为隐绿原酸,峰4为咖啡酸,峰5为葛根素,峰9为4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸,峰10为黄芩苷,峰11为连翘苷,峰12为牛蒡苷。色谱图见图2。

2.7 计量学分析

2.7.1 相似度计算 将13批样品数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统,以对照特征图谱为参照,进行共有峰匹配后计算相似度,结果见表3,可知均高于0.98,表明各批样品之间差异较小。

表3 13批样品相似度

2.绿原酸 3.隐绿原酸 4.咖啡酸 5.葛根素 9.4,5-O-二咖啡酰奎宁酸 10.黄芩苷 11.连翘苷 12.牛蒡苷2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4.caffeic acid 5.puerarin 9.isochlorogenic acid C 10.baicalin 11.phillyrin 12. arctiin图2 各成分HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituens

2.7.2 聚类分析 通过SPSS19.0软件,以13个共有峰峰面积为变量,采用组间联接系统聚类法中的欧氏距离对13批样品进行聚类分析,结果见图3。由此可知,各批样品大致分为2类,S1~S3聚为一类,生产日期为2016年;S4~S13聚为另一类,生产日期为2019年。

图3 13批样品聚类分析图Fig.3 Cluster analysis plot for thirteen batches of samples

2.8 各成分含量测定

2.8.1 溶液制备

2.8.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品,50%甲醇制成每1 mL分别含牛蒡苷0.208 89 mg、黄芩苷0.291 09 mg、葛根素0.030 57 mg、隐绿原酸0.099 0 mg的溶液,即得。

2.8.1.2 供试品溶液 精密量取口服液2 mL,置于50 mL量瓶中,50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.8.2 方法学考察

2.8.2.1 线性关系考察 取“2.8.1.1”项下对照品溶液,50%甲醇稀释(牛蒡苷0.013 93、0.034 82、0.069 63、0.104 45、0.139 26、0.174 08、0.208 89 mg/mL,黄芩苷0.019 41、0.048 52、0.097 03、0.145 55、0.194 06、0.242 58、0.291 09 mg/mL,葛根素0.002 04、0.005 10、0.010 19、0.015 29、0.020 38、0.025 48、0.030 57 mg/mL,隐绿原酸0.006 6、0.016 5、0.033 0、0.049 5、0.066 0、0.082 5、0.099 0 mg/mL),在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,得方程分别为牛蒡苷Y=1.768 0×107X-5.531 9×104(r=0.999 9)、黄芩苷Y=1.731 1×107X-4.899 7×104(r=1.000 0)、葛根素Y=3.038 2×107X-1.910 9×104(r=1.000 0)、隐绿原酸Y=1.399 1×107X-2.297 0×104(r=0.999 9),分别在0.013 93~0.208 89、0.019 41~0.291 09、0.002 04~0.030 57、0.006 6~0.099 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.8.2.2 精密度试验 取“2.8.2.1”项下各成分第3个质量浓度的对照品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定6次,测得牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸峰面积RSD分别为1.16%、0.92%、0.89%、1.03%,表明仪器精密度良好。

2.8.2.3 重复性试验 取样品(S1),按“2.8.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,测得牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸含量RSD分别为1.10%、0.37%、0.23%、0.66%,表明该方法重复性良好。

2.8.2.4 稳定性试验 取供试品溶液(S1),于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”项色谱条件下进样测定,测得牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸峰面积RSD分别为0.86%、0.12%、0.42%、1.12%,表明溶液在25 h内稳定性良好。

2.8.2.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的样品6份(S1),按“2.8.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,每份精密量取1 mL至50 mL量瓶中,精密加入对照品溶液[牛蒡苷(0.208 9 mg/mL)5 mL、黄芩苷(0.242 6 mg/mL)10 mL、葛根素(0.101 9 mg/mL)3 mL、隐绿原酸(0.099 0 mg/mL)5 mL],50%甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,计算回收率,结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.8.3 样品含量测定 取13批样品,按“2.8.1.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL测定,外标法计算含量,结果见表5。

表5 各成分含量测定结果(mg/mL,n=3)

3 讨论

3.1 检测波长选择 本实验采用二极管阵列检测器对8种成分的紫外吸收光谱进行扫描,发现在230 nm下色谱峰数目较多,而且除黄芩苷外均有较好的吸收;该处波长虽为黄芩苷较低吸收,但可减少与其他色谱峰的差异,同时各成分色谱峰峰形、分离度均较好。因此,选择230 nm作为检测波长。

3.2 耐用性考察 本实验考察了4种色谱柱(Agilent Extend-C18,5 μm,250 mm×4.6 mm;依利特Hypersil BDS C18,5 μm,250 mm×4.6 mm;Thermo BDS Hypersil C18,5 μm, 250 mm×4.6 mm;Thermo ODS C18,5 μm,250 mm×4.6 mm),其中Agilent Extend、Thermo BDS Hypersil色谱柱重复性较好。然后,对新购买的、使用不同年限的色谱柱进行,发现其重复性均较好。

3.3 HPLC特征图谱分析 对13批小儿解表口服液进行聚类分析,发现不同生产年限样品分别聚为一类,推测可能是由于原料受生长环境、采收时间、加工贮存等因素的影响;另一方面,口服液长时间放置容易出现沉淀,会带来稳定性方面的问题,隐绿原酸等酚酸类成分易分解转化[16-17],而黄芩苷等黄酮类成分溶解性较差,也可能影响稳定性。另外,相同生产年限的不同批次样品虽然个别共有峰略有差异,但其质量基本稳定。

4 结论

本实验建立了小儿解表口服液HPLC特征图谱,确定了13个共有峰,通过与对照药材比对归属了方中7个药味,再与对照品比对指认了其中8种成分,发现13批样品相似度均大于0.98,表明特征图谱能较全面反映制剂整体状况。同时,建立了专属性较强的牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸含量测定方法,可为小儿解表口服液的质量控制提供参考依据。

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