小儿解表口服液HPLC特征图谱建立及4种成分测定

汪 冰， 解盈盈， 薛 菲， 翟士旭， 林永强*

(1.山东省食品药品检验研究院，山东省中药标准创新与质量评价工程实验室，山东 济南 250101；2.威海人生药业集团股份有限公司，山东 济南 250022)

小儿解表口服液由金银花、葛根、牛蒡子、黄芩、连翘、蒲公英、紫苏叶等药材经提取而成，具有宣肺解表，清热解毒之功效，临床主要用于治疗小儿外感风热引起的恶寒发热、头痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛痒[1-4]。该制剂现行质量控制标准主要是连翘苷、黄芩苷、葛根素的TLC定性鉴别和金银花中绿原酸定量测定[5]，虽然在一定程度上保障了产品质量，但无法全面反映其质量状况。因此，本实验建立小儿解表口服液HPLC特征图谱，并对隐绿原酸、葛根素、黄芩苷、牛蒡苷含量进行测定，以期从整体上评价该制剂质量[6-15]。

1 材料

Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司，配置二极管阵列检测器、Empower 2色谱工作站)；CP225D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Milli-Q 超纯水系统(美国默克密理博公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(功率500 W，昆山市超声仪器有限公司)。小儿解表口服液13批，购自威海人生药业集团股份有限公司，批号分别为20161201(S1)、20161202(S2)、20161203(S3)、0190101(S4)、0190102(S5)、0190103(S6)、0190104(S7)、0190201(S8)、0190202(S9)、0190203(S10)、0190301(S11)、0190302(S12)、0190303(S13)。

绿原酸(批号110753-201314，纯度96.6%)、黄芩苷(批号110715-201117，纯度91.7%)、葛根素(批号110752-201313，纯度95.5%)、连翘苷(批号110821-201615，纯度94.9%)、牛蒡苷(批号110819-200606)、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸(批号111894-201102)、咖啡酸(批号110885-200102)对照品均购自中国食品药品检定研究院；隐绿原酸对照品(批号MUST-19032403，纯度99.07%)购自成都普思生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为Millipore纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，梯度洗脱(0～10 min，10%A；10～35 min，10%～25%A；35～40 min，25%～35%A；40～43 min，35%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长230 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，50%甲醇制成每1 mL分别含绿原酸45.24 μg、隐绿原酸33.00 μg、咖啡酸5.04 μg、葛根素20.38 μg、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸41.56 μg、黄芩苷97.03 μg、连翘苷14.80 μg、牛蒡苷69.63 μg的溶液，即得。

2.2.2 对照药材溶液 取蒲公英、金银花、紫苏叶、葛根、黄芩、连翘、牛蒡子对照药材各0.1 g，25 mL 50%甲醇超声处理30 min，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液 精密量取口服液2 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按制剂处方和工艺，分别制备缺蒲公英、缺金银花、缺葛根、缺黄芩、缺连翘、缺牛蒡子、缺紫苏叶阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 特征图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品(S1)，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，所得色谱图中1～8号峰以绿原酸为参照，9～13号峰以黄芩苷为参照，测得13个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别小于0.5%、1.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取样品(S1)，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，所得色谱图中1～8号峰以绿原酸为参照，9～13号峰以黄芩苷为参照，测得13个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均分别小于0.5%、1.5%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取样品(S1)，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，所得色谱图中1～8号峰以绿原酸为参照，9～13号峰以黄芩苷为参照，测得13个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均分别小于0.5%、1.0%，表明溶液在25 h内稳定性良好。

2.4 图谱生成 按“2.2.3”项下方法制备13批样品的供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)对其色谱图进行分析(图1)，选择重复性、分离度较好，可归属到处方药味的13个色谱峰作为共有峰。由于共有峰在图谱中主要分布于前后部分，较为分散，故以保留时间适中、峰面积较大、分离度较好的2号峰(绿原酸)、10号峰(黄芩苷)为参照，保留时间在25 min前的1～8号峰选择前者，25 min后的9～13号峰选择后者，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1～2。

图1 13批样品HPLC特征图谱Fig.1 Characteristic HPLC chromatograms of thirteen batches of samples

表1 共有峰相对保留时间

表2 共有峰相对峰面积

2.5 共有峰相对保留时间规定值确定 以绿原酸为参照峰1，计算前8个共有峰的相对保留时间；以黄芩苷为参照峰2，计算后5个共有峰的相对保留时间。以13批样品HPLC特征图谱中13个共有峰的相对保留时间平均值为规定值，分别为0.93(峰1)、1.00(峰2)、1.15(峰3)、1.40(峰4)、1.50(峰5)、1.86(峰6)、1.94(峰7)、2.32(峰8)、0.87(峰9)、1.00(峰10)、1.04(峰11)、1.07(峰12)、1.16(峰13)，并且偏差均应在±5%以内。由表2可知，8个共有峰相对峰面积RSD较大(>10%)，故只规定共有峰相对保留时间，而不规定其相对峰面积。

2.6 共有峰指认及归属 通过与对照药材溶液、阴性样品溶液色谱峰进行比较，可判定1号色谱峰来自蒲公英，2号色谱峰为金银花、蒲公英、牛蒡子的共有峰，3号色谱峰来自金银花，4号色谱峰为蒲公英、紫苏叶的共有峰，5～8号色谱峰来自葛根，9号色谱峰为金银花、蒲公英的共有峰，10、13号色谱峰来自黄芩，11号色谱峰来自连翘，12号色谱峰来自牛蒡子。再进行对照品定位及紫外光谱比较，确定峰2为绿原酸，峰3为隐绿原酸，峰4为咖啡酸，峰5为葛根素，峰9为4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸，峰10为黄芩苷，峰11为连翘苷，峰12为牛蒡苷。色谱图见图2。

2.7 计量学分析

2.7.1 相似度计算 将13批样品数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以对照特征图谱为参照，进行共有峰匹配后计算相似度，结果见表3，可知均高于0.98，表明各批样品之间差异较小。

表3 13批样品相似度

2.绿原酸 3.隐绿原酸 4.咖啡酸 5.葛根素 9.4,5-O-二咖啡酰奎宁酸 10.黄芩苷 11.连翘苷 12.牛蒡苷2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4.caffeic acid 5.puerarin 9.isochlorogenic acid C 10.baicalin 11.phillyrin 12. arctiin图2 各成分HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituens

2.7.2 聚类分析 通过SPSS19.0软件，以13个共有峰峰面积为变量，采用组间联接系统聚类法中的欧氏距离对13批样品进行聚类分析，结果见图3。由此可知，各批样品大致分为2类，S1～S3聚为一类，生产日期为2016年；S4～S13聚为另一类，生产日期为2019年。

图3 13批样品聚类分析图Fig.3 Cluster analysis plot for thirteen batches of samples

2.8 各成分含量测定

2.8.1 溶液制备

2.8.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品，50%甲醇制成每1 mL分别含牛蒡苷0.208 89 mg、黄芩苷0.291 09 mg、葛根素0.030 57 mg、隐绿原酸0.099 0 mg的溶液，即得。

2.8.1.2 供试品溶液 精密量取口服液2 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.8.2 方法学考察

2.8.2.1 线性关系考察 取“2.8.1.1”项下对照品溶液，50%甲醇稀释(牛蒡苷0.013 93、0.034 82、0.069 63、0.104 45、0.139 26、0.174 08、0.208 89 mg/mL，黄芩苷0.019 41、0.048 52、0.097 03、0.145 55、0.194 06、0.242 58、0.291 09 mg/mL，葛根素0.002 04、0.005 10、0.010 19、0.015 29、0.020 38、0.025 48、0.030 57 mg/mL，隐绿原酸0.006 6、0.016 5、0.033 0、0.049 5、0.066 0、0.082 5、0.099 0 mg/mL)，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程分别为牛蒡苷Y=1.768 0×107X-5.531 9×104(r=0.999 9)、黄芩苷Y=1.731 1×107X-4.899 7×104(r=1.000 0)、葛根素Y=3.038 2×107X-1.910 9×104(r=1.000 0)、隐绿原酸Y=1.399 1×107X-2.297 0×104(r=0.999 9)，分别在0.013 93～0.208 89、0.019 41～0.291 09、0.002 04～0.030 57、0.006 6～0.099 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.8.2.2 精密度试验 取“2.8.2.1”项下各成分第3个质量浓度的对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸峰面积RSD分别为1.16%、0.92%、0.89%、1.03%，表明仪器精密度良好。

2.8.2.3 重复性试验 取样品(S1)，按“2.8.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸含量RSD分别为1.10%、0.37%、0.23%、0.66%，表明该方法重复性良好。

2.8.2.4 稳定性试验 取供试品溶液(S1)，于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸峰面积RSD分别为0.86%、0.12%、0.42%、1.12%，表明溶液在25 h内稳定性良好。

2.8.2.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的样品6份(S1)，按“2.8.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，每份精密量取1 mL至50 mL量瓶中，精密加入对照品溶液[牛蒡苷(0.208 9 mg/mL)5 mL、黄芩苷(0.242 6 mg/mL)10 mL、葛根素(0.101 9 mg/mL)3 mL、隐绿原酸(0.099 0 mg/mL)5 mL]，50%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.8.3 样品含量测定 取13批样品，按“2.8.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL测定，外标法计算含量，结果见表5。

表5 各成分含量测定结果(mg/mL，n=3)

3 讨论

3.1 检测波长选择 本实验采用二极管阵列检测器对8种成分的紫外吸收光谱进行扫描，发现在230 nm下色谱峰数目较多，而且除黄芩苷外均有较好的吸收；该处波长虽为黄芩苷较低吸收，但可减少与其他色谱峰的差异，同时各成分色谱峰峰形、分离度均较好。因此，选择230 nm作为检测波长。

3.2 耐用性考察 本实验考察了4种色谱柱(Agilent Extend-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；依利特Hypersil BDS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；Thermo BDS Hypersil C18，5 μm, 250 mm×4.6 mm；Thermo ODS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm)，其中Agilent Extend、Thermo BDS Hypersil色谱柱重复性较好。然后，对新购买的、使用不同年限的色谱柱进行，发现其重复性均较好。

3.3 HPLC特征图谱分析 对13批小儿解表口服液进行聚类分析，发现不同生产年限样品分别聚为一类，推测可能是由于原料受生长环境、采收时间、加工贮存等因素的影响；另一方面，口服液长时间放置容易出现沉淀，会带来稳定性方面的问题，隐绿原酸等酚酸类成分易分解转化[16-17]，而黄芩苷等黄酮类成分溶解性较差，也可能影响稳定性。另外，相同生产年限的不同批次样品虽然个别共有峰略有差异，但其质量基本稳定。

4 结论

本实验建立了小儿解表口服液HPLC特征图谱，确定了13个共有峰，通过与对照药材比对归属了方中7个药味，再与对照品比对指认了其中8种成分，发现13批样品相似度均大于0.98，表明特征图谱能较全面反映制剂整体状况。同时，建立了专属性较强的牛蒡苷、黄芩苷、葛根素、隐绿原酸含量测定方法，可为小儿解表口服液的质量控制提供参考依据。