过表达hnRNPAB基因对结直肠癌细胞上皮-间质转化的影响及其分子机制

袁涛，江航，陈正权，文坤明

遵义医科大学附属医院胃肠外科，贵州遵义 563003

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中居第3位，病死率居第2位[1]。手术切除和放化疗是CRC的主要治疗方式[2]，然而，即使实施了标准的根治手术及放化疗，CRC患者的5年总生存率(约65%)仍未见明显改善，肿瘤复发和转移是其治疗失败的主要原因[3]。研究发现，上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transitions，EMT)与多种恶性肿瘤(包括CRC)的复发、转移、耐药等恶性生物学行为密切相关，最终导致治疗失败[4]。本课题组前期研究发现，hnRNPAB在CRC组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，且hnRNPAB高表达与CRC分期和患者预后不良密切相关[5]。hnRNPAB对结直肠癌细胞EMT过程的调控作用研究较少。本研究旨在探讨过表达hnRNPAB基因对人结直肠癌SW480、HT29细胞EMT的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、L-15培养基(培养SW480细胞)、5A培养基(培养HT29细胞)购自美国HyClone公司；2.5%胰酶购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；细胞全蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白、WNT3A、WNT5A、β-catenin、GAPDH和β-tubulin一抗以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗购自美国Proteintech公司。过表达hnRNPAB的慢病毒(hnRNPAB-GFP-PURO)及阴性对照病毒(NC-GFPPURO)由上海汉恒生物科技有限公司构建。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒转染实验 人结直肠癌SW480、HT29细胞购自上海中科院细胞库。分别用hnRNPAB-GFPPURO和NC-GFP-PURO转染SW480、HT29细胞，设置实验组(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)与对照组(SW480-NC、HT29-NC)。转染步骤：将细胞于含10% FBS的培养基中培养，待细胞融合度达到80%以上时进行病毒转染；转染前1 d，用0.25%胰酶消化细胞并接种于24孔板中(1×105个/孔)；采用阴性对照病毒确定两种细胞的转染条件及感染复数(multiplicity of infection，MOI)值，根据MOI值计算每孔所需病毒量[病毒体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/ml]，每孔加入

2.5 μl 聚凝胺(polybrene，2 mg/ml)，然后加入培养基补充体积至500 μl/孔，48 h后更换新鲜培养基，72 h后倒置显微镜下观察荧光并拍照，收集细胞并采用RT-qPCR和Western blotting鉴定转染病毒后hnRNPAB过表达的效果。

1.2.2 RT-qPCR检测hnRNPAB mRNA的表达水平

收集细胞，使用Trizol试剂提取总RNA，并测定总RNA浓度。取0.8 μg总RNA，反转录成cDNA，按照PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒说明书步骤操作。采用SYBR Green染料法行实时PCR，总反应体积为20 μl。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃15 s。设置3个复孔，实验重复3次。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法确定目的基因mRNA相对表达量。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.3 划痕实验检测细胞迁移能力 将细胞接种于24孔板中(3×105个/孔)，待细胞长满孔板后，用1 ml注射器针头沿孔板中轴垂直划线，用PBS清洗3次去除脱落细胞，加入培养基继续培养，显微镜下观察0 h、24 h后细胞迁移情况并拍照，用Image pro软件测量后计算划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h的划痕距离－24 h的划痕距离)/0 h的划痕距离×100%。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力 用无血清培养基培养细胞12 h使其处于饥饿状态，然后取1×105个细胞，离心去上清，用250 μl无血清培养基重悬后接种于Transwell小室上室中，将Transwell小室放入24孔板(下室)中，下室中加入600 μl含10%FBS的培养基，培养24 h后取出Transwell小室，用0.1%结晶紫染色，随机选取5个视野，显微镜下计数穿膜细胞数，取平均值。

1.2.5 Western blotting检测hnRNPAB、E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白、WNT3A、WNT5A及β-catenin蛋白的表达水平 收集细胞，按照全蛋白提取试剂盒说明书步骤提取总蛋白并测定浓度；取40 μg总蛋白，根据目的蛋白分子量在相应浓度的凝胶上进行分离，然后转移至PVDF膜上；加入5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，加入鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白、WNT3A、WNT5A、β-catenin、GAPDH和β-tubulin一抗(1:2000)4 ℃孵育过夜；次日以TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:10 000)室温孵育1 h；TBST洗膜3次，置于ECL发光液中2 min后，用X线胶片曝光显现蛋白质条带，扫描胶片后所得条带用Quantity-One软件进行分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参GAPDH蛋白条带的灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0及GraphPad prism 5.0软件进行统计分析和制图。所有数据以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 慢病毒转染结直肠癌SW480、HT29细胞的效果 结直肠癌SW480、HT29细胞分别转染hnRNPAB-GFP-PURO和NC-GFP-PURO，72 h后，荧光倒置相差显微镜下可见绿色荧光(图1)，表明病毒转染成功。

图1 结直肠癌SW480、HT29细胞转染病毒72 h后的效果(×100)Fig.1 Effects of colorectal cancer SW480 and HT29 cells transfected with virus for 72 hours (×100)

2.2 结直肠癌SW480、HT29细胞转染病毒后hnRNPAB过表达效果鉴定 RT-qPCR检测结果显示，与对照组比较，实验组hnRNPAB mRNA表达水平分别提高了2.1倍(SW480：3.10±0.26vs.1.00±0.18，P＜0.01)和1.7倍(HT29：2.70±0.21vs.1.00±0.12，P＜0.01)。

Western blotting检测结果显示，与对照组相比，实验组结直肠癌细胞中hnRNPAB蛋白表达水平明显升高(SW480：1.02±0.06vs. 0.67±0.05，P＜0.01；HT29：1.07±0.04vs. 0.58±0.03，P＜0.01，图2)，表明hnRNPAB在SW480和HT29细胞中被成功过表达。

图2 Western blotting检测结直肠癌细胞中hnRNPAB蛋白表达水平Fig.2 hnRNPAB protein levels in colorectal cancer cells detected by Western blotting

2.3 hnRNPAB过表达对结直肠癌细胞迁移能力的影响 划痕实验结果显示，与对照组相比，实验组划痕愈合率明显增高(SW480：19.6%±0.90%vs.2.23%±0.80%，P＜0.01；HT29：40.30%±0.70%vs.6.40%±0.06%，P＜0.01，图3)。

图3 划痕实验检测结直肠癌细胞的迁移能力Fig.3 The ability of migration of colorectal cancer cells detected by scratch test

2.4 hnRNPAB过表达对结直肠癌细胞侵袭能力的影响 Transwell实验结果显示，与对照组相比，实验组穿膜细胞数明显增多[SW480：(315.0±6.7)个vs. (62.0±4.3)个，P＜0.01；HT29：(289.0±7.2)个vs. (54.0±5.2)个，P＜0.01，图4]。

图4 Transwell实验检测结直肠癌细胞的侵袭能力(×100)Fig.4 The ability of invasion of colorectal cancer cells detected by Transwell assay (×100)

2.5 hnRNPAB过表达对结直肠癌细胞中E-cadherin、N-cadherin及波形蛋白mRNA和蛋白表达的影响RT-qPCR检测结果显示，与对照组(SW480-NC、HT29-NC)相比，实验组(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)结直肠癌细胞中上皮细胞标志物E-cadherin mRNA表达水平明显降低(P＜0.01)，间质细胞标志物N-cadherin和波形蛋白mRNA表达水平在SW480细胞中分别提高了1.1倍和1.5倍，在HT29细胞中则分别提高了0.9倍和1.7倍，差异有统计学意义(P＜0.01，表2)。

表2 结直肠癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和波形蛋白mRNA和蛋白表达情况(±s)Tab.2 The mRNA and protein levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in colorectal cancer cells (±s)

表2 结直肠癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和波形蛋白mRNA和蛋白表达情况(±s)Tab.2 The mRNA and protein levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in colorectal cancer cells (±s)

与SW480-NC比较，(1)P＜0.01；与HT29-NC比较，(2)P＜0.01。

组别 E-cadherin N-cadherin 波形蛋白mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白SW480-NC 1.02±0.07 0.67±0.04 1.00±0.06 0.61±0.02 1.03±0.05 0.59±0.02 SW480-hnRNPAB 0.65±0.04(1) 0.50±0.02(1) 2.13±0.08(1) 0.91±0.03(1) 2.45±0.04(1) 0.88±0.02(1)HT29-NC 1.01±0.05 0.61±0.03 1.07±0.07 0.59±0.04 1.03±0.04 0.62±0.03 HT29-hnRNPAB 0.58±0.07(2) 0.47±0.05(2) 1.92±0.09(2) 0.95±0.04(2) 2.69±0.11(2) 0.92±0.05(2)

Western blotting检测结果显示，与对照组(SW480-NC、HT29-NC)相比，实验组(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)结直肠癌细胞中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平明显降低，间质细胞标志物N-cadherin蛋白和波形蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01，表2、图5)。

图5 Western blotting检测结直肠癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和波形蛋白表达水平Fig.5 The expression levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in colorectal cancer cells detected by Western blotting

2.6 hnRNPAB过表达对结直肠癌细胞中WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达的影响 Western blotting检测结果显示，与对照组比较，实验组结直肠癌细胞中WNT3A(SW480：0.87±0.04vs. 0.47±0.03，P＜0.01；HT29：0.91±0.03vs.0.52±0.04，P＜0.01)、WNT5A(SW480：0.92±0.05vs. 0.53±0.04，P＜0.01；HT29：0.96±0.06vs.0.62±0.05，P＜0.01)及β-catenin(SW480：1.02±0.03vs. 0.58±0.02，P＜0.01；HT29：1.08±0.04vs.0.59±0.03，P＜0.01)蛋白表达水平均明显升高，差异有统计学意义(图6)。

图6 Western blotting检测结直肠癌细胞中WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达水平Fig.6 The protein levels of WNT3A, WNT5A and β-catenin in colorectal cancer cells detected by Western blotting

3 讨 论

结直肠癌是发病率和病死率均较高的恶性肿瘤，肿瘤复发和转移是其治疗失败的主要原因[6]。研究发现，EMT可增强肿瘤细胞的迁移、侵袭能力，最终导致肿瘤复发和转移[7]。目前EMT的启动机制仍不清楚，亟需进一步深入研究，以为结直肠癌的治疗提供新的靶点及切入点。hnRNPAB属于hnRNPs家族，是一类与mRNA生物学功能密切相关的RNA结合蛋白，参与核酸代谢的多个方面，包括RNA剪接、维持端粒酶活性、细胞信号传导以及转录和翻译调控等[8-10]。hnRNPAB包括4种亚型：hnRNPA1、hnRNPA2/B1(又称hnRNPA2或hnRNPB1)、hnRNPA3和hnRNPA0[8]。目前研究发现，hnRNPAB及其亚型与多种恶性肿瘤的恶性生物学行为，如增殖、抗细胞凋亡和预后不良密切相关[11-13]，且能够调控肿瘤细胞的EMT过程[14-16]。但hnRNPAB是否参与结直肠癌细胞EMT过程的调控，目前尚未见文献报道。

EMT是一种复杂的分子及细胞程序，在胚胎形态发生、组织纤维化、伤口愈合和癌细胞转移中起着重要作用[17]。当EMT被激活时，上皮标志物E-cadherin的表达受到抑制，细胞因此失去极性和细胞间的黏附能力，并表达与间质细胞状态相关的标志物，如N-cadherin、波形蛋白等，从而导致上皮特征的逐渐丧失并伴随着间质特征的获得[18]，使细胞获得了运动和侵袭能力，从其原发部位扩散并在远处形成继发性肿瘤[19]。为了明确hnRNPAB是否能够诱导结直肠癌细胞发生EMT，本研究采用过表达hnRNPAB的慢病毒和阴性对照病毒转染SW480、HT29细胞，转染72 h后通过RT-qPCR和Western blotting检测hnRNPAB mRNA及蛋白的表达以验证hnRNPAB过表达的效果，结果显示，实验组(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)hnRNPAB mRNA及蛋白的表达水平均较对照组(SW480-NC、HT29-NC)明显升高，表明hnRNPAB在SW480和HT29细胞中被成功过表达。本研究结果还显示，实验组划痕愈合率明显高于对照组，穿膜细胞数明显多于对照组，表明过表达hnRNPAB基因增强了SW480和HT29细胞的迁移和侵袭能力。进一步通过RT-qPCR和Western blotting检测EMT标志物mRNA和蛋白的表达，结果显示，与对照组相比，实验组上皮细胞标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达明显降低，而间质细胞标志物N-cadherin和波形蛋白mRNA和蛋白表达明显增高，表明过表达hnRNPAB基因诱导SW480和HT29细胞发生了EMT，从而增强了细胞的迁移和侵袭能力。

目前研究发现，hnRNPAB及其亚型可调节Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达：Stockley等[20]采用RNA干扰敲减前列腺癌细胞hnRNPAB亚型hnRNPA2(hnRNPA2/B1)的表达后，细胞的增殖及克隆形成能力明显减弱，而过表达hnRNPA2则促进了前列腺癌细胞的增殖，其机制与hnRNPA2促进CTNNB1(编码β-catenin蛋白)mRNA及蛋白的表达有关；Meng等[21]发现，hnRNPAB亚型hnRNPA1可促进间充质干细胞(MSCs)向软骨分化，其机制与促进Wnt信号通路中WNT3A、WNT5A及β-catenin蛋白的表达有关。有研究证实，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与CRC的复发、转移等恶性生物学行为密切相关[22-23]。本研究采用Western blotting检测结直肠癌细胞中WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白的表达水平，结果显示，实验组WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表达水平较对照组升高，提示过表达hnRNPAB基因可导致Wnt/β-catenin信号通路激活。

综上所述，本研究结果表明，过表达hnRNPAB基因可诱导结直肠癌SW480和HT29细胞发生EMT，增强其迁移和侵袭能力，其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。该结果为hnRNPAB在临床上用于结直肠癌的分子靶向治疗提供了理论依据。但本研究仅在体外细胞水平证实了hnRNPAB对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响，而体内功能验证及其EMT与Wnt/β-catenin信号通路之间的具体调控机制尚需进一步研究。