喷施KH2PO4对孕穗期低温胁迫下小麦叶片抗氧化特性与幼穗冻害的影响

苏 慧，李金鹏，胡燕美，朱玉磊，李金才，宋有洪

(安徽农业大学农学院，安徽合肥 230036)

黄淮海平原是我国最大的小麦生产基地，该地区小麦年生产量占全国的70%左右[1]。近几十年来，随着全球气候变暖，极端低温发生的频率、强度和持续时间都在不断的增加[2-3]，低温冷害对世界各国小麦生产均产生了很大影响[4-6]。孕穗期是小麦幼穗发育的关键生育时期，该阶段幼穗对温度反应敏感，此时期的低温冷害会对小麦生产带来较大影响[7]。研究表明，孕穗期低温胁迫主要影响小穗发育，进而影响幼穗结实性，尤其是上部小穗在冻害发生后容易会出现变白现象或部分死亡，严重时造成小麦大幅减产[8-9]。研究发现，在小麦孕穗期0 ℃连续处理3 d，单株产量较对照降低87.9%～97.8%[10]。孕穗期低温胁迫会引起小麦植株发生一系列的变化，包括代谢酶的失活[11]、渗透物质的积累[12-13]、内源激素含量及光合特性的改变[14]，最终影响小麦小穗发育和物质运输。

利用外源物质减轻作物遭受逆境胁迫后的危害已成为国内外研究的热点之一，常见的外源物质有KH2PO4[15]、水杨酸[16]、脱落酸[17]、海藻糖[18]、胺类物质[19]等。KH2PO4是一种磷钾高效复合肥，具有促进叶片光合作用、增强作物抗逆性的功能。因为钾离子(K+)在植物体内能通过影响叶绿素的降解和淀粉的合成等方式来调节作物的光合作用[20]，并且K+能够维持同化物向韧皮部的运输，因而增加K+营养供应可提高植物对低温胁迫的耐受性[21]。研究发现，水稻孕穗期叶面喷施KH2PO4后群体叶面积指数提高，群体干物质积累量显著增加[22]。在水稻穗分化期低温条件下喷施KH2PO4能提高穗粒数、结实率和千粒重，进而达到增产的效果[23]。小麦孕穗期喷施KH2PO4能提高叶片光合性能，增强抗氧化酶活性，显著提高小麦产量[24]。尽管KH2PO4在不同作物中的逆境调节具有重要作用，且发现KH2PO4在15 mmol·L-1(0.2%)的浓度下效果更佳[25]，但是目前在小麦孕穗期低温胁迫发生前喷施KH2PO4对幼穗冻害的缓解作用及其调控机理尚不明确。

鉴于此，本研究针对黄淮海麦区小麦生产中面临的孕穗期低温胁迫问题，以两种抗寒性不同的小麦为试验材料，低温处理前叶面喷施0.2% KH2PO4溶液，考察低温后小麦幼穗冻害情况以及小穗形态和旗叶生理特征和结实率的变化，探讨孕穗期喷施KH2PO4对小麦低温胁迫的缓解作用，以期为黄淮海麦区倒春寒防控提供理论 参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选用烟农19(冬性、低温不敏感型)和新麦26(半冬性、低温敏感型)为试验材料。

1.2 试验地概况

试验于2018-2019年在安徽农业大学农萃园(北纬N31°52′0.99″，东经E117°16′57.72″)进行。试验采用盆栽种植，盆栽土壤取自于农萃园土壤耕层(0～20 cm土层)。耕层土壤有机质含量10.6 g·kg-1，全氮含量1.13 g·kg-1，速效氮含量 81.5 mg·kg-1，速效磷含量33.1 mg·kg-1，速效钾含量 76.2 mg·kg-1。盆钵直径为30 cm，高度为25 cm，每盆装土10 kg。全生育期施225 kg N·hm-2、120 kg P2O5·hm-2和120 kg K2O·hm-2，其中磷肥、钾肥作为基肥一次性施入，氮肥的基追比例为5∶5(拔节期追肥)。基肥按目标施肥量计算，采用稀释法与土壤混合拌匀，装入盆钵里；拔节肥于叶龄余数2.5叶时追施。播种前每盆浇水800 mL，播种后覆 1 cm土。播种期为2018年10月20日，每盆播种16粒种子，三叶期定苗，最终留苗8株，每品种播40盆，田间管理按一般高产栽培要求进行。在超低温光照培养箱(DGXM-1008，宁波江南仪器厂)中进行低温处理。

1.3 试验设计

于小麦孕穗期选取植株长势一致的盆钵，进行一次低温处理(2 ℃和-2 ℃)，低温时间为23:00-04:00，其他时间设置15 ℃。在低温处理前两天的上午8：00-9：00(晴朗无风)叶面喷施0.2% KH2PO4溶液，连续两次，每盆每次喷施量为200 mL，以喷施等量清水为对照。处理结束后移至自然条件下生长至成熟。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 小穗冻害程度等级的划分

在低温后10 d(冻害症状已经完全显示)，每盆随机抽取5株小麦，三次重复。调查主茎小穗的冻害情况，根据全国小麦区域试验冻害5级指标进行冻害程度的调查。0级：幼穗未产生伤害；1级：幼穗<1/3受到伤害；2级：幼穗1/3～1/2受到伤害；3级：幼穗1/2～3/4受到伤害；4级：幼穗>3/4受到伤害或全部冻死。

冻害发生率=达到冻害级别的茎蘖数/总茎蘖数×100%

冻害指数=∑[冻害等级(0级以上)×冻害发生率]/4

1.4.2 绿素含量的测定

低温结束第一天取各处理小麦旗叶待测。采用浸提法[26-27]测定旗叶的叶绿素含量，低温环境下取5片旗叶剪碎混合均匀后称取0.2 g，三次重复，加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺，于4 ℃避光条件下浸提24 h至叶片完全变白后过滤，过滤浸提液采用UV-1800紫外可见分光光度计(日本，岛津)分别测量647 nm、664 nm和470 nm下OD值，计算叶绿素(叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素三者的总和)含量。

1.4.3 酶活性测定

低温结束第一天取各处理小麦旗叶0.1 g，重复三次，用液氮研磨，加5 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS，pH=7.8；0.1% PVPP)，低温冷冻离心机离心，上清液即为所需酶液。过氧化物酶(POD)活性测定参考愈创木酚法[28]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定[29]。采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性[30]。以每分钟OD值变化 0.1为一个酶活单位。

1.4.4 丙二醛(MDA)含量的测定

低温结束后第一天取各和目不暇接小麦旗叶0.5 g，重复三次，加5% TCA 5 mL研磨后所得匀浆在3 000 r·min-1下离心10 min，得上清液。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[31]。

1.4.5 主茎穗上部内部结构观察

低温结束第一天取各处理主茎穗上部小穗待测。将新鲜上部小穗立即用配好的FAA固定液(50%酒精∶乙酸∶甲醛=90∶5∶5)固定24 h，置于4 ℃冰箱保存用于后续制作石蜡切片，石蜡切片制作方法采用番红-固绿双重染色法[32]。

1.4.6 主茎穗上部糖含量的测定

低温结束第一天取各处理小麦主茎穗上部，105 ℃杀青后70 ℃烘干至恒重，再将样品研磨成粉末，过筛(40目)。称取样品粉末0.05 g，三次重复，加入 2 mL 80%的酒精，混合均匀，80 ℃恒温水浴浸提40 min，于4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，重复浸提两次，合并上清液，用80%酒精定容至8 mL，再加10 mg活性炭吸附色素40 min，用滤纸过滤去除活性炭，滤液即为所需提取液。

蔗糖含量测定采用间苯二酚法[33]，测量其485 nm处的吸光度值，用蔗糖做标准曲线；果糖含量测定也采用间苯二酚法[34]，取0.4 mL提取液，加入0.8 mL 0.1%间苯二酚，2.8 mL 30% HCl，80 ℃下温育10 min，置于流水冷却，在测量其480 nm处的吸光度值，用果糖做标准曲线；还原糖含量测定采用3.5-二硝基水杨酸法(DNS法)[35]，测定其540 nm处的吸光度值，以葡萄糖做标准曲线。

1.4.7 主茎结实率测定

在小麦成熟后，随机收取10株主茎穗，三次重复，调查单株结实率，求主茎穗的平均结实率。

1.5 数据处理

试验数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析，用Duncan分析方法进行多重比较，并使用Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦小穗冻害程度的影响

随着温度的降低，小麦小穗冻害程度加重(表1)。2 ℃下仅发生1、2和3级冻害，无4级冻害；-2 ℃下开始出现4级冻害，2级和3级冻害发生率增加，冻害指数呈上升趋势。低温处理下，新麦26轻度冻害发生率显著低于烟农19，而其2级、3级和4级冻害发生率显著高于烟农19；同一温度下，喷施KH2PO4能显著提高轻度冻害发生率，显著降低2级、3级和4级的冻害发生率，两品种的冻害指数在2 ℃和-2 ℃下分别降低至0.20～0.27和0.25～0.30。总之，喷施KH2PO4能显著降低幼穗冻害指数，-2 ℃下缓解效果好于 2 ℃，与新麦26相比，烟农19喷施降低冻害效果更明显。

表1 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦幼穗冻害发生率的影响Table 1 Effect of KH2PO4 spraying on freezing injury rate of young spike of wheat under low temperature at the booting stage

2.2 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦旗叶叶绿素含量的影响

低温导致小麦旗叶叶绿素含量显著下降。喷施0.2% KH2PO4能显著提高小麦旗叶的叶绿素含量(图1)。与喷施清水对照相比，喷施KH2PO4后，喷施烟农19和新麦26的叶绿素含量在2 ℃下分别提高21.2%和17.7%，在-2 ℃下分别提高了14.8%和11.3%，说明孕穗期低温前喷施0.2% KH2PO4能维持较高的叶片叶绿素含量，从而有利于降低低温危害程度。

2.3 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦旗叶保护性酶活性的影响

由表2可知，随着温度降低，两个小麦品种旗叶的三种保护性酶活性均显著提高；同一温度下，喷施KH2PO4能显著提高小麦旗叶的保护性酶活性。与喷施等量清水相比，喷施KH2PO4后，烟农19和新麦26的SOD、POD和CAT活性在2 ℃下分别提高了13.4%、78.4%、58.4%和 7.5%、67.0%和50.4%，在-2 ℃下分别提高了 5.9%、12.3%、26.7%和19.7%、1.0%、14.9%。

相同品种图柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P< 0.05)。图2和图4同。

表2 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦旗叶保护性酶活性的影响Table 2 Effect of KH2PO4 spraying on protective enzyme activity in flag leaves of wheat under low temperature at booting stage

由此可知，喷施KH2PO4能显著提高旗叶的抗氧化能力，有利于增强小麦抗逆性，在2 ℃下效果较明显。

2.4 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦旗叶MDA含量的影响

小麦旗叶的MDA含量随着温度的降低而升高(图3)。相比于喷施清水对照，喷施KH2PO4后烟农19旗叶的MDA含量在2 ℃和-2 ℃下分别降低了5.7%和22.1%，新麦26旗叶的MDA含量分别降低了12.1%和31.0%；其中，在-2 ℃下喷施KH2PO4对小麦旗叶MAD含量的影响达显著水平。这表明喷施KH2PO4能不同程度减轻低温胁迫对小麦的膜脂损伤。

图2 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦旗叶MDA含量的影响

2.5 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦主茎穗上部细胞结构的影响

从小穗解剖结果可以看出，低温影响小麦主茎穗上部细胞解剖结构。随着温度的降低，细胞损伤程度加重，薄壁细胞变形，核糖体数目减少，开始产生质壁分离。与2 ℃下的细胞形态和结构图3A)相比，在-2 ℃下烟农19小穗的薄壁细胞较明显变形，结构损伤严重，核糖体数目明显减少；新麦26的损伤程度更严重(图3C)。与喷施清水对照相比，喷施KH2PO4后小麦主茎穗上部核糖体数目增多，核仁凝集程度更高，基粒片层排列整齐、规则，细胞活性较高(图3B、D、F、H)。由此可见，喷施KH2PO4能缓解低温胁迫对上部小穗的影响，维持细胞完整性，保证器官的正常功能。

2.6 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦主茎穗上部可溶性糖含量的影响

随着温度的降低，主茎穗上部的蔗糖和果糖含量上升，还原糖含量下降(表2)。与喷施清水对照相比，喷施KH2PO4后蔗糖和果糖的含量显著降低，降幅分别为5.6%～63.1%和12.2%～ 27.5%；而还原糖含量显著提高，增幅4.4%～ 33.2%。由此可见，喷施KH2PO4能通过改变糖含量和组成来调整细胞液浓度，从而对低温伤害起到减轻作用。

2.7 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦结实性的影响

两个品种小麦的结实率随着温度的降低而显著下降(图4)。相比于喷施清水对照，喷施KH2PO4后，烟农19和新麦26的结实率在2 ℃下分别提高17%和10%，在-2 ℃下分别提高11%和8%，说明孕穗期低温发生前喷施KH2PO4能显著增强小麦穗结实能力，有利于产量形成。

A～D表示烟农19的四个不同处理：A表示2 ℃对照，B表示2 ℃喷施KH2PO4，C表示-2 ℃对照，D表示-2 ℃喷施KH2PO4,E～H表示新麦26的四个不同处理，顺序同烟农19。

表3 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦主茎穗上部糖含量的影响Table 3 Effect of KH2PO4 spraying on contents of soluble sugar of main stem spikes of wheat under low temperature stress at booting stage

3 讨 论

研究表明，春季低温胁迫对小麦穗数和穗粒数有显著的影响[36]，尤其是孕穗期低温胁迫可导致小麦穗粒数降幅达55.1%，这也是低温胁迫下小麦产量降低的主要原因[37]。小麦孕穗期遭遇低温主要加速了幼穗中小花退化，减少可育小花数和结实籽粒数，从而致使小麦结实率大幅度下降[38]。研究发现，通过叶片喷施外源物质能一定程度上可降低低温胁迫对小麦带来的危害[39-40]。本试验结果表明，孕穗期低温处理后小麦结实率下降，而不同低温处理前通过叶面喷施KH2PO4则显著降低了低温危害程度，相比于喷施清水处理，两个品种下喷施KH2PO4小麦的结实率分别提高了11%～17%和8%～10%(图4)。由此说明，小麦孕穗期低温胁迫前喷施 0.2% KH2PO4可通过增强穗结实能力来缓解对小麦产量形成带来的不利影响。

图4 喷施KH2PO4对孕穗期低温下小麦结实率的影响

孕穗期是小麦幼穗发育的关键生育时期，该时期小穗对低温十分敏感，低温胁迫会导致小穗畸形发育[41]。此外，小麦穗上部发育进程迟于中部，孕穗期低温胁迫更容易对小麦上部小穗的结构造成更大程度的破坏，导致物质向小穗运输过程受阻，进而造成籽粒败育，降低结实率[42]。本研究发现，喷施KH2PO4均明显提高了小麦穗上部不同器官细胞结构的稳定性，使器官内细胞之间排列更加紧密，细胞核的数目明显增多(图3)；同时，喷施KH2PO4能减轻小麦幼穗的冻害程度，显著降低了小麦在不同低温胁迫下的冻害指数(表1)，且均在-2 ℃的减轻效果更明显。孕穗期低温发生前喷施KH2PO4显著地降低了主茎穗上部的蔗糖和果糖的含量，提高了其还原糖的含量，说明KH2PO4能促进小麦植株渗透调节物质快速恢复，推动了小麦由受冻缓慢生长向正常生长的转变，这与李春燕等[43]研究成果较为 一致。

旗叶作为小麦的主要光合器官，其光合性能对小麦其他部位的物质供应有很大的影响。叶片充足的物质生产及供应能力对保证幼穗的物质供应和提高抗逆性具有重要的作用。研究表明，低温会破坏小麦叶片中叶绿体和叶肉细胞的膜结构，引起叶绿素含量下降，降低叶片光合性能[44]。KH2PO4作为一种重要的调节物质，在作物关键生育时期喷施可以增强叶片抗逆性，提高物质生产能力，从而增加干物质积累量和产量[22-24]。本研究结果表明，降低温度导致小麦旗叶的叶绿素含量下降，提高保护性酶活性，而在相同低温下喷施KH2PO4后小麦旗叶的叶绿素含量和保护性酶活性均显著提高，从而能降低逆境下产生的活性氧对叶片的不利影响。总之，本试验结果表明了小麦孕穗期低温前喷施KH2PO4可降低低温胁迫对叶片的物质生产及供应能力的不利影响，有利于减轻冻害对幼穗的伤害。

本研究进一步证实孕穗期低温胁迫前喷施KH2PO4能起到减轻低温对小麦伤害，但有关KH2PO4在小麦春季低温胁迫防控中对小麦不同部位小穗、小花育性的影响及其分子机制尚需进一步的探究。

4 结 论

孕穗期低温处理前每盆喷施200 mL 0.2% KH2PO4能提高旗叶光合生产对穗部的物质供应，调控低温对小麦旗叶和穗部生理的影响，有效抑制低温对小麦幼穗的损伤，降低低温对小麦产量造成的损失。喷施KH2PO4缓解机制主要体现在旗叶清除活性氧能力的提高，维持叶片光合性能，从而保证旗叶对小穗发育的物质供应，提升了小穗结构完整性与糖含量。