高分子量麦谷蛋白亚基组成及其与小麦品质性状的关系分析

范家霖，陈晓杰，张建伟，程仲杰，王嘉欢，张福彦，杨保安

(河南省科学院同位素研究所有限责任公司/河南省核农学重点实验室，河南郑州 450015)

小麦是我国主要粮食作物之一，适合制作馒头、面条、面包、糕点、饼干等多种食品，以满足消费者的不同需求[1]。随着我国经济的快速发展、人民物质生活水平的逐渐提高以及居民膳食结构的改变，消费者对小麦品质的要求越来越高。我国小麦生产不断进行结构性调整和供给侧改革，逐渐从单纯产量型向优质、高产、高效型转变，品质改良已成为我国小麦育种的重要目标之一[2]。长期以来，我国小麦蛋白质含量并不低，但蛋白质和面筋的质量较差，面筋强度和延展性有待进一步提高，小麦品质较国外品种偏差[3]。醇溶蛋白和麦谷蛋白的不同构成比例和特性对小麦面筋质量、面团粘弹性等加工特性具有决定作用[4]。小麦醇溶蛋白分为α、β、γ、ω四种类型，主要影响面团的延展性；麦谷蛋白分为高分子量麦谷蛋白(HMW)和低分子量麦谷蛋白(LMW)，分别占胚乳总蛋白含量的10%和40%左右[5]。尽管HMW在小麦籽粒中的含量较低，但HMW仍是目前公认的影响小麦面粉品质的关键因素，影响约60%的面包烘烤品质性状变异[6-7]。

Payne和Corfield[8]利用SDS-PAGE的方法鉴定分析了小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的组成，并发现Glu-A1位点上的x1亚基影响小麦面粉的烘烤品质。此后，国内外学者对HMW-GS的组成及其与小麦品质的关系开展了大量的研究。HMW-GS由小麦第一同源染色体上3个复合位点上的编码基因控制，被命名为Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1，分别位于1A、1B、1D染色体长臂上[9]。不同HMW-GS编码基因保守区序列高度一致，而重复序列上SNP位点差异或DNA片段的插入、缺失致使HMW-GS形成不同的类型[10-11]。不同HMW-GS类型对小麦品质效应不同，不同的亚基和亚基组合类型对小麦品质的贡献也不尽相同。国内外学者研究表明，小麦优质亚基主要有Glu-A1位点上的x1和x2*亚基，Glu-B1位点上的x7+y8、x7OE+y8、x14+y15、x13+y16和x17+y18亚基，Glu-D1位点上的x5+y10亚基，而Glu-B1位点上的x20亚基和Glu-D1位点上的x2+y12亚基则对小麦加工品质具有负效应[12-14]。我国小麦品种的HMW-GS组成非常丰富，但优质亚基出现的频率偏低，且不同生态区域内小麦HMW-GS组成及其对小麦品质的效应也存在一定差异。我国北方麦区部分小麦品种的HMW-GS组成对蛋白质含量和沉降值的效应不同，在北方麦区品种中没有发现具有明显优势的亚基组合类型，优质亚基 1Ax2*、1Bx17+1By18和1Bx14+1By15出现的频率较低[14]。我国黄淮南片小麦品种中Glu-A1位点上的x1亚基、Glu-B1位点上x7+y8和x17+y18亚基、Glu-D1位点上的x5+y10亚基对蛋白质含量、湿面筋含量、沉淀值、形成时间、稳定时间等品质性状都具有较大的正向效应[15]。河北、山西等小麦品种(系)中以1Ax1、1Bx14+1By15、 1Dx2+1Dy12亚基为主；Glu-B1位点上的4种亚基在各个品质指标间均存在显著差异，其中x7+y8亚基对蛋白质含量和湿面筋含量的贡献最高， x17+y18亚基对沉淀值和最大抗延阻力的贡献最高，而携带x7+y9亚基的面团则具有最长的稳定时间[16-17]。HMW-GS丰富的遗传多样性可为我国小麦品质育种的优质亚基聚合提供有利条件。育种家通过有目的改良小麦HMW-GS优质亚基的组成，进而提高蛋白质质量、面筋强度等品质性状，提升我国小麦品质，增强我国小麦品种的国际竞争力。截止目前，尽管已有关于小麦HMW-GS组成与蛋白质含量、湿面筋含量、沉淀值等品质性状关系研究的相关报道，但有关HMW-GS组成对吸水率、最大抗延阻力以及拉伸面积等面团流变学特性影响的研究尚无报道。本研究拟通过对127份小麦种质资源的HMW-GS组成和吸水率、最大抗延阻力、拉伸面积、稳定时间等主要品质性状进行检测，分析HMW-GS单个亚基及其组合与小麦品质性状的关系，旨在明确优质亚基的主要品质功能，为我国小麦品质的遗传改良提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料04中36、豫丰11、济麦44、郑品麦22号、郑品麦24号、漯6073、豫同113、西农979、郑品优18、小偃81、周麦27、周麦36、郑品优9号等127份小麦品种(系)来自河南省科学院同位素研究所小麦育种室收集的种质资源圃，这些材料主要涵盖了黄淮海麦区近20年来生产种植的小麦品种(系)。

1.2 试验方法

1.2.1 田间试验

2018—2019年度在河南省科学院新郑试验基地种植，每个品种(系)种植2行，行长2.5 m，行距0.25 m，每行播50粒种子，待出苗后每行定苗至30株左右。田间管理同大田生产，正常成熟后人工收获、脱粒，及时晾晒后贮藏备用。

1.2.2 品质性状检测

将收获后的小麦品种(系)种子在同一储藏条件下放置2个月，水分控制在11%～13%之间。利用DA7200型近红外谷物分析仪测定籽粒蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值；利用Perten 4100型单粒谷物特性测定仪测定小麦的籽粒硬度、水分含量等。依据硬度和水分含量进行润麦，其中硬质麦润麦至水分含量为16.5%，混合麦为 15.5%，软质麦为14.5%，用Chopin CD1型实验磨粉机进行磨粉，出粉率65%左右。利用Farinograph-E电子型粉质仪测定面粉吸水率、面团稳定时间、形成时间等品质性状；利用拉伸仪测定最大抗延阻力、延伸性、拉伸面积等品质性状。

1.2.3 小麦籽粒蛋白提取

参照纪 军等[18]方法(稍有改动)进行小麦麦谷蛋白的提取和制备。选取1粒大小均匀一致的小麦种子充分研磨后放入2.0 mL离心管中，加入500 μL提取液A(7.5%异丙醇+0.3 mol·L-1NaI)制成悬浮液，65 ℃水浴30 min，期间震荡2～3次，使悬浮液充分混匀；12 000 r·min-1离心3 min，弃上清液后，再重复提取一次。向沉淀中加入200 μL提取液B[25%异丙醇+0.04 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)+10%SDS+2%二硫苏糖醇(DTT)]，65 ℃水浴30 min，期间震荡几次，充分混匀，再加入200 μL提取液C[25%异丙醇+0.04 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)+10%SDS+1.4%4-乙烯吡啶(4-VP)]后65 ℃水浴30 min，期间震荡2～3次，使悬浮液充分混匀，12 000 r·min-1离心5 min，吸取200 μL上清液，转移到另一个干净的1.5 mL离心管中，加入200 μL样品缓冲液[0.625 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)+20%甘油+ 0.5%溴酚蓝+5%β-巯基乙醇]，轻微震荡使其充分混匀，静置30 min后，99 ℃加热变性5 min，所得样品即为麦谷蛋白溶液，自然冷却后将制备的蛋白样品直接进行电泳分析或-20 ℃保存备用。

1.2.4 SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳参照纪 军等[18]和Khalid等[19]的方法进行。制备浓度为13%聚丙烯酰胺分离胶[0.375 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.8)、0.1%SDS]和5%聚丙烯酰胺浓缩胶[0.125 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)、0.1%SDS]，将 1.2.3中制备的麦谷蛋白样品取5 μL点样，用 0.025 mol·L-1Tris、0.1%SDS和0.19 mol·L-1甘氨酸配制的电极缓冲液进行电泳，12 mA稳流电泳10 h，待溴酚蓝条带离开凝胶30 min后结束电泳。小心剥离凝胶,在12%的三氯乙酸溶液浸泡中10 min, 用蒸馏水冲洗干净后进行染色和脱色，直至背景浅淡、带型清晰，将凝胶扫描成像并保存。

按照Payne等[20-21]提出的“字母-数字”命名标准确定参试材料的HMW-GS亚基类型，用已知HMW-GS带型的郑麦366(1Ax1、1Bx7+1By8、1Dx5+1Dy10)、小偃22(1Ax-null、1Bx7+1By9、1Dx2+1Dy12)和小偃81(1Ax1、1Bx14+1By15、1Dx2+1Dy12)为对照。

1.3 统计分析

利用Microsoft Excel 2013进行数据统计和表格绘制，采用SPSS 18.0进行方差分析(ANOVA)和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 HMW-GS组成及频率

部分参试小麦品种(系)HMW-GS的SDS-PAGE电泳鉴定结果见图1。127份小麦品种(系)中，共鉴定出1Ax1、1Ax-null、1Bx7+1By8、1Bx7+1By9、1Bx14+1By15、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10和1Dx2+1Dy12共8种亚基类型。在Glu-A1位点上，x1亚基类型出现的频率最高，占70.1%，x-null亚基类型出现频率为 29.9%；在Glu-B1位点上，x7+y8、x7+y9、x14+y15和x17+y18出现的频率分别为34.7%、 42.5%、19.7%和3.1%；在Glu-D1位点上，x5+y10和x2+y12亚基类型出现频率为51.2%和 48.8%。

1：中麦578；2：郑品麦8号；3：豫丰11；4：郑品麦24号；5：郑品优18；6：郑麦366(CK1)；7：豫农202；8：郑品优9号；9：丰德存麦5号；10：郑麦9023；11：商麦156；12：藁城8901；13：小偃81(CK2)

127份供试材料中，共鉴定出14种HMW-GS组合类型，其分布频率见表1。1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10和1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12组合类型出现的频率较高，分别占参试材料的18.9%和17.3%，其次为1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10和1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12组合类型，分别占12.6%和 11.0%。其余组合类型出现的频率较低，其中1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10组合类型仅有2份材料，占1.6%；1Ax1/1Bx17+1By18/1Dx2+1Dy12组合类型仅有1份材料，占0.8%。

表1 供试材料HMW-GS组合类型及其分布频率Table 1 HMW-GS combinations and the frequency of the 127 wheat varieties(lines)

2.2 小麦品质性状分析

由表2可知，测定的所有品质性状中，蛋白质含量和吸水率的变异系数较小，蛋白质含量变化范围为11.30%～17.50%，吸水率变化范围为50.80%～66.50%，其变异系数分别为6.90%和5.68%，而稳定时间、最大抗延阻力和拉伸面积的变异较大，其中，稳定时间变化范围为1.10 min～25.40 min，其变异系数高达79.96%，最大抗延阻力和拉伸面积的变异系数分别为59.74%和59.28%。总体来看，参试材料中黄淮麦区品种(系)的沉降值、稳定时间、最大抗延阻力和拉伸面积的变化范围较大，变异系数较高，遗传多样性 丰富，具有较大的遗传改良潜力，为直接筛选出综合品质性状较优的小麦种质资源创造了有利 条件。

表2 127份小麦品种(系)的品质性状Table 2 Quality performance of 127 wheat varieties(lines)

2.3 HMW-GS亚基分布及其对小麦品质的影响

在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点共检测到8种HMW-GS亚基，且不同位点上的不同亚基对蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、吸水率、稳定时间等小麦品质性状影响不同。结果(表3)显示，在Glu-A1位点上，携带x1亚基材料的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、稳定时间、最大抗延阻力和拉伸面积显著高于携带x-null的小麦品种(系)。在Glu-B1位点上，4种亚基对小麦品质指标的影响也不尽相同，其中携带x7+y8亚基品种(系)的沉降值、吸水率、稳定时间、最大抗延阻力、拉伸面积均显著高于携带其他3种亚基类型的材料，而携带x17+y18亚基材料的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、稳定时间均显著高于携带x14+y15亚基和x7+y9亚基的材料，而携带x7+y9亚基品种(系)的除吸水率外其他品质指标显著低于携带其他3种亚基类型的材料，x14+y15亚基对除蛋白质含量和湿面筋含量以外的其他品质性状有负向效应；Glu-D1位点上，携带x5+y10亚基材料的蛋白质含量、沉降值、稳定时间、最大抗延阻力和拉伸面积均高于携带x2+y12亚基的材料，差异达到显著水平，湿面筋含量显著低于携带x2+y12亚基的材料，而二者的吸水率差异不 显著。

表3 不同HMW-GS亚基对小麦品质的影响Table 3 Effect of different HMW-GS subunits on wheat quality

2.4 不同HMW-GS组合与品质效应的关系

127份供试材料中共发现14种HMW-GS组合类型，分析样本数量大于3的12种不同组合类型与品质效应的关系，结果(表4)表明，携带不同HMW-GS组合类型品种(系)的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、吸水率、稳定时间、最大抗延阻力和拉伸面积等品质性状存在不同程度差异。携带1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10品种(系)的蛋白质含量、沉降值、吸水率、稳定时间、最大抗延阻力、拉伸面积等品质性状明显较高，而携带1Ax1/1Bx17+1By18/1Dx5+1Dy10、1Ax1/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10、1Ax-null/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10和1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx2+1Dy12品种(系)的蛋白质含量、沉降值、稳定时间、最大抗延阻力、拉伸面积等品质性状也较高。携带1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10和1Ax1/1Bx14+1By15/1Dx2+1Dy12材料的品质性状表现一般，而携带1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12和1Ax-null/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10的品种(系)在蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、稳定时间、最大抗延阻力、拉伸面积等品质性状均明显较低。

表4 不同HMW-GS组合类型与小麦品质效应的关系Table 4 Relationship between different HMW-GS combination types and quality effect of wheat

3 讨 论

我国小麦品种的HMW-GS组成丰富，不同生态区域内不同来源小麦种质的HMW-GS组成和分布存在一定的差异。谢科军等[15]研究发现，黄淮南片小麦品种中1Ax1(73.5%)、1Bx7+1By8(24.3%)和1Dx5+1Dy10(48.0%)优质亚基的比例较高，而含有1Ax2*(0.6%)、1Bx14+1By15(11.9%)、1Bx13+1By16(0.6%)、1Bx17+1By18(3.4%)、和1Dx5+1Dy12(1.1%)等稀有优质亚基的比例偏少。Gao等[16]发现，河北小麦品种携带1Ax1(43.0%)、1Bx7+1By8 (64.9%)、1Dx2+1Dy12亚基(74.8%)的比例较高，携带优质亚基1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By8、1Bx14+1By15、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10和1Dx5+1Dy12的比例呈逐渐上升趋势。王 倩等[17]研究发现，山西水地小麦品系中携带1Ax1亚基的品系所占比例高达83.7%，而Glu-B1位点存在4种亚基类型，以x14+y15亚基(42.9%)为主，Glu-D1位点存在x2+y12 (71.4%)和x5+y10(28.6%)两种亚基类型。权 威等[22]对国外小麦种质资源的HMW-GS组成进行分析，在Glu-A1位点发现x-null、x1和x2*三种亚基，其中优质亚基x2*(31.8%)所占的比例较高；Glu-B1位点上发现x7+y9、x17+y18、x7、x13+y16、x7*+y16*等14种亚基类型；Glu-D1位点发现x5+y10、x2+y12、x-null、x5+y12等5种亚基类型。本研究在供试材料Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点共发现8种亚基类型，其中优质亚基1Ax1(70.1%)、1Bx7+1By8 (34.7%)、1Bx14+1By15(19.7%)和1Dx5+1Dy10(51.2%)所占比例较高，而1Bx17+1By18 (3.1%)亚基出现的频率较低，没有发现1Ax2*和1Dx5+1Dy12类型的优质亚基。由此可见，我国小麦优质亚基利用仍较为单一，主要以1Ax1、1Bx7+1By8和1Dx5+1Dy10为主，而1Ax2*、1Bx7OE+1By8、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy12等其他优质亚基甚少。因此，在今后的强筋优质小麦品种培育中应加大对携带国外优质稀有亚基材料的利用。

HMW-GS与小麦主要品质性状的关系极为密切。国内外学者对不同HMW-GS亚基以及组合类型与小麦品质的关系等方面已做较多研究。Horvat等[23]研究发现，1Ax1和1Dx5+1Dy10亚基的存在使得小麦品种具有优良的面包品质，Glu-D1位点上的亚基对面包的品质的影响最为显著，y型HMW-GS的相对含量对面团拉伸阻力和能量、面包体积和面包外观等面包品质的影响大于x型。在相同低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)背景下，金 慧等[24]研究HMW-GS对面团流变学特性和面包加工品质的影响，结果发现，HMW-GS对延展性的影响不显著，而对面团强度、不溶性谷蛋白聚合体和面包加工品质的影响显著，其中对面团强度效应大小为Glu-D1>Glu-B1>Glu-A1，对面包加工品质效应大小为Glu-D1>Glu-A1>Glu-B1，Glu-D1位点亚基对面包品质效应贡献最大，这与Horvat等[23]研究结果基本一致。就单个亚基而言1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By9、1Bx17+1By18和1Dx5+1Dy10对小麦品质影响较大，而1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10亚基组合为品质改良的最佳组合。张金乾等[25]对陇东地区小麦资源的HMW-GS组成和品质分析，发现携带1Ax2*/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy12亚基组合的小麦品种(系)综合品质性状较优。张自阳等[26]研究发现，国外引进种质和黄淮冬麦区种质的HMW-GS亚基类型较为丰富，且优质亚基出现的频率较高，1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By8、1Bx17+1By18、Dx5+1Dy10亚基对面筋强度和面团稳定时间均具有明显的正向效应；1Ax2*、1Bx17+1By18、Dx2+1Dy10亚基对馒头的硬度和咀嚼性具有明显的正向效应，携带1Bx14+1By15亚基材料的湿面筋含量较高，但面团稳定时间较短，而携带1Bx17+1By18亚基材料的面团稳定时间较长，且馒头的硬度和咀嚼性均较好。本研究发现，1Ax1、1Bx7+1By8、1Bx17+1By18、Dx5+1Dy10亚基对蛋白质含量、沉降值、稳定时间、最大抗延阻力和拉伸面积等品质性状有显著正向效应，而1Bx14+1By15亚基对除蛋白质含量和湿面筋含量以外的其他品质性状有负向效应，这与张自阳等[26]研究认为1Bx14+1By15是优质亚基，对面包、面条和饺子等面制品的品质具有重要影响的结果不同，这可能是由于二者所选用试验材料和品质分析方法不同所致。本研究进一步分析发现，携带1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10品种(系)的蛋白质含量、沉降值、吸水率、稳定时间、最大抗延阻力、拉伸面积等品质性状高于携带其他组合类型的品种(系)，而携带1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12和1Ax-null/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10品种(系)的各个品质性状低于携带其他组合类型的品种(系)。

本研究发现，少数小麦品种(系)HMW-GS亚基组成与品质性状表现不一致，如个别携带优质亚基组合的1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10品种(系)的品质性状表现一般，而个别携带1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12和1Ax-null/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10的材料蛋白质含量、沉降值、稳定时间、最大抗延阻力等品质性状反而高于携带优质亚基组合的材料。这可能是由于小麦品质性状除受HMW-GS影响外，还受LMW-GS、醇溶蛋白含量、环境因素、制粉工艺及其他不同基因间调控等因素的影响，也可能是由于本试验选用的小麦材料数量偏少，其代表性存在一定的局限性。本研究没有发现优质亚基1Ax2*、1Bx7OE+1By8、1Bx13+1By16、1Dx5+1Dy12等，在今后的小麦优质强筋育种工作中应注重从外引小麦或近缘种属中发现和挖掘优质HMW-GS，并加大这些优质亚基组合的育种利用，进一步丰富我国小麦种质资源的遗传多样性，为培育优质强筋小麦新品种提供优异育种材料。