新型冠状病毒核酸检测试剂盒比对研究*

刘冬冬，何绍平，姜亚运，袁成良

(德阳市人民医院检验科,四川 德阳 618000)

2020年，一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)被发现，研究显示存在人传人现象[1-2]。病毒基因测序后，与核苷酸序列数据库(GenBank)比对，发现其与非典(SARS) 病毒相似[3]。新型冠状病毒感染席卷全球，在许多国家暴发流行，随着各地病例数的增多，部分地区报道了无症状感染者的存在[4]。无症状感染者的存在可导致疑似感染者及密切接触者数量大量增加，加速疫情的蔓延。相比病毒测序，实时荧光PCR试剂研发和生产速度较快[5]，操作简单、耗时短、成本低[6]，所以实时荧光PCR检测新型冠状病毒核酸成为确诊COVID-19的主要方法。自中国疾控中心公布新型冠状病毒基因序列后，许多公司迅速推出新型冠状病毒核酸检测试剂盒。但目前仅有少量文献对新型冠状病毒核酸检测试剂进行评价[7-9]。

本研究以已获得中国疾控中心批准上市的上海之江生物技术有限公司的新型冠状病毒核酸检测试剂作为比对试剂，检测了14例COVID-19确诊患者，以及211例普通入院患者咽拭子样本中的新型冠状病毒核酸，对不同试剂的新型冠状病毒核酸阳性检出率及Ct值进行了对比观察，评价迈克生物股份有限公司的同类试剂的检测性能，为临床及检测部门选取合适的检测试剂提供依据。

1 资料与方法

1.1标本来源 14例咽拭子阳性标本来源于四川省疾控中心确诊的COVID-19患者，211例咽拭子阴性标本来源于2020年2月18日至2月24日211例普通入院筛查患者。

1.2检测试剂与仪器 新型冠状病毒核酸检测试剂：试剂A(上海之江生物科技股份有限公司，批号P20200209，国械注准20203400057)，试剂B(迈克生物股份有限公司，批号020041，国械注准20203400184)。两种试剂的基本信息见表1。

表1 两种核酸检测试剂盒的基本信息

1.3检测方法 在生物安全柜内，打开标本转运箱，取出待检标本。将咽拭子采样管充分振荡混匀后静置10 min，取上清液1 mL 转移至2 mL 螺口管中。采用上海之江生物科技有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒(批号:20200201)和EX3600全自动核酸提取仪提取咽拭子的RNA，具体操作参照试剂盒说明书。参照各试剂盒说明书进行PCR反应体系配制、反应参数和程序的设置。采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，结果以Ct值表示。

2 结 果

2.1两种试剂检测的新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、E基因的Ct值比较 两种试剂对14例标本的各基因检测Ct值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。两种检测试剂结果判读对14例COVID-19确诊患者标本判读均为阳性，211例普通入院患者判读为210例阴性，1例无效，重复实验后判读为阴性，考虑是操作的偶然误差。

表2 两种核酸检测试剂盒的检测结果比较

2.2两种试剂检测的新型冠状病毒 ORF1ab基因、N基因、E基因的相关性分析 为进一步探究两种试剂检测结果的一致性，将迈克和之江的新型冠状病毒检测结果作散点图，并进行相关性分析。结果显示，两种试剂检测新型冠状病毒中的ORF1ab基因、N基因、E基因的相关系数(r)分别为0.824、0.834和0.890，均P<0.01，见图1。由此，我们认为迈克与之江的新型冠状病毒核酸检测试剂检测结果一致性良好。

A.ORF1ab基因；B.N基因；C.E基因。

2.3参考比对试剂，迈克检测结果的相对偏差分析 参考之江新型冠状病毒核酸检测结果，迈克的ORF1ab基因、N基因的相对偏差均在±16%以内，且均在评价范围的标准之内，见表3。内参基因的相对偏差略大，可能是两种试剂盒所检测的基因片段存在差异。

表3 两种核酸检测试剂盒的检测结果

3 讨 论

目前，国外感染人数仍不断增加，全球疫情仍十分严峻。国家卫生健康委员会发布了《关于加快推进冠病毒核酸检测的实施意见》，提出积极扩大新型冠状病毒核酸检测范围，全力排查风险隐患，要求重点人群“应检尽检”，其他人群“愿检尽检”。因此，国内外对核酸检测试剂需求量日益增加。COVID-19诊断较为复杂，需结合流行病史、临床表现和实验室检查结果综合判断[10]。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，实时荧光PCR检测新型冠状病毒核酸阳性为确诊病例的病原学“金标准”之一[11]。

2020年1月，我国科研工作人员通过基因组测序成功破译新型冠状病毒全基因组序列，并提交在GenBank和virologic.org网站。随后，各种新型冠状病毒检测试剂盒相继面世，因PCR方法有着灵敏度高、特异性强和易操作的优点[12]，目前已成为检测新型冠状病毒核酸的主要方法[13]。加之临床诊疗工作需要检测得及时和准确，无症状感染者需早发现、早隔离，实时荧光PCR的核酸检测仍是其主要的确诊方法。但新型冠状病毒核酸检出率只有30%～50%[14]，除去检测样本的影响，检测试剂盒未经过大量临床样本优化也是一个重要因素[15]。所以，新型冠状病毒核酸检测试剂经过完整的性能验证及临床试验验证，对减少结果假阴性或假阳性十分重要。

本研究中，以我国法定检验机构检定合格的首个新型冠状病毒检测产品，且已获得中国疾控中心国家药品监督管理局批准的上海之江生物技术有限公司的新型冠状病毒核酸检测试剂作为比对试剂，与迈克生物技术有限公司的新型冠状病毒核酸检测试剂进行比较。采用盲法平行测定，数据显示阳性检出率和阴性符合率一致性，ORF1ab基因、N基因和E基因的检测相关性较强，检测相对偏差均在可接受范围内。综上所述，与已获批上市的试剂比对，迈克生物技术有限公司的新型冠状病毒核酸检测试剂可满足临床需求，具有临床适用性。