QuEChERS-气相色谱—三重四极杆质谱法同时测定黑茶中10种酰胺类除草剂残留

易守福 梁 锋 何青科 宋 阳 廖燕芝

(1. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410017；2. 食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410017)

黑茶中含有500多种化合物，富含蛋白质、维生素和氨基酸等，具有极高的营养价值，长期饮用还具有很好的减肥、降血脂效果[1]。黑茶因其保健功能和独特品质，深受广大消费者喜爱。然而黑茶的采茶周期长，春、夏、秋三季均可采摘新鲜茶叶，茶叶在大面积种植过程中，为保障茶叶品相、防虫除草，增加了除草剂等农药的使用几率和农药残留的风险。黑茶是湖南省主要的茶叶品种，其中安化黑茶又为国家地理标志产品，其产品质量对黑茶的国内外市场具有重要影响。酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的触杀性农药，具有广谱、高效和施用方便等特点[2-3]。然而此类农药过量使用后易在地表水和土壤中残留[4]，进而通过食物链对人体健康造成危害。美国环保局已将甲草胺、乙草胺、丁草胺等用量较大的酰胺类除草剂列为对人类可能致癌的物质[5]。欧盟国家制定了严格的限量标准，规定茶叶中酰胺类农药的最大残留限量为0.05～0.10 mg/kg，而中国食品安全标准暂未对茶叶中酰胺类除草剂的限量作出规定，限制了中国茶叶的出口贸易。

目前对于酰胺类除草剂残留量的检测方法主要有气相色谱法(GC)[6]、高效液相色谱—质谱法(HPLC-MS)[7]、高效液相色谱—串联质谱法(HPLC-MS/MS)[8-10]、气质联用色谱法(GC-MS)[3,11]及气相色谱—串联质谱法(GC-MS/MS)[12]。由于黑茶基质较复杂，在质谱检测分析时可能带来基体效应和基质干扰的影响，故在进行质谱分析前，采取适当的前处理方法尤为重要。目前酰胺类除草剂的前处理方法主要有加速溶剂萃取(ASE)[13]、固相萃取(SPE)法[14-15]和QuECHERS法[10-11,16]，传统的前处理方法存在操作繁琐，有机溶剂用量大，价格昂贵等缺点。QuEChERS方法具有操作简便快速、净化效果好、有机溶剂消耗少、环境友好等优点，被广泛应用于基质复杂的样品中农药残留的检测[17]。

研究拟采用QuEChERS前处理净化，结合GC-MS/MS检测技术，以建立快速、高效、准确的同时测定黑茶中10种酰胺类除草剂残留的检测方法，为不同茶叶品种中酰胺类除草剂残留的检测提供参考，同时也为茶叶中酰胺类除草剂的监测监管提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

湖南安化黑茶、广西六堡茶、云南普洱茶、四川藏茶、陕西黑茶、湖北青砖茶：市售；

炔苯酰草胺、乙草胺、异丙甲草胺、氟酰胺、丙炔氟草胺：纯度99%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

丙草胺、丁草胺、异丙草胺、吡氟酰草胺、二甲草胺、甲草胺：100 mg/L，上海安谱实验科技股份有限公司；

乙腈、乙酸乙酯：色谱纯，美国TEDIA试剂公司；

丙酮：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；

氯化钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

净化组A[含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mgN-丙基乙二胺(PSA)]、净化组B[含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，10 mg 石墨化碳黑(GCB)]、净化组C(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，50 mg GCB)：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱—三重四极杆质谱仪：Thermo Scientific TSQ 9000型，赛默飞世尔科技公司；

台式离心机：TG16-WS型，湘仪离心机仪器有限公司；

旋涡混匀器：IKA MS3型，德国艾卡集团；

华晨高速多功能粉碎机：HCP-1000A型，浙江省永康市金穗机械制造厂；

电子分析天平：BSA124S-CW型，德国赛多利斯集团；

超纯水仪：2WM-UT1-10型，中沃水务环保科技有限公司。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备液 分别准确称取炔苯酰草胺、乙草胺、异丙甲草胺、氟酰胺、丙炔氟草胺10 mg，加入少量乙酸乙酯溶解，转移至100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制质量浓度为100 mg/L的单标储备液，-18 ℃避光贮藏。

1.3.2 混合标准中间液 分别吸取10种酰胺类除草剂储备液(100 mg/L)各0.5 mL于同一10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释并定容，配制成5.0 mg/L的混合标准中间溶液，-18 ℃避光贮藏。

1.3.3 混合标准工作液 用乙酸乙酯将标准中间液逐级稀释配制成质量浓度为0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.500 mg/L的混合标准工作液。

1.3.4 基质混合标准工作液 取经净化后的空白基质溶液1 mL于40 ℃水浴下氮吹至干，精密移取1.0 mL相应浓度的混合标准工作液复溶，过滤膜，配制成基质混合标准工作液，基质混合标准工作液现配现用。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件优化 色谱柱为TG-5 SILMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度280 ℃；升温程序：初始温度120 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升温至240 ℃，以30 ℃/min升温至300 ℃，保持 5 min。载气为高纯氦气(纯度>99.999%)；载气控制方式为恒定流量；流速1.0 mL/min；进样方式为不分流模式，进样量1 μL。

1.4.2 质谱条件优化 电子轰击离子源(EI源)；离子源温度300 ℃；传输线温度280 ℃；碰撞气为高纯氦气(纯度>99.999%)；选取1.0 mg/L酰胺类除草剂标准溶液在m/z50～500内运行MS1全扫描，根据所得的色谱图和质谱图确定保留时间和特征离子，在质谱图中选择1～2个丰度较高且m/z较大的离子作为MRM方法的母离子。对母离子进行子离子扫描和碰撞能优化，碰撞电压5～50 eV，每间隔5 eV进行一次碰撞，根据碎片离子丰度，确定定性离子对和定量离子对。

1.5 样品前处理条件优化

1.5.1 提取溶剂优化 称取粉碎过筛后的黑茶样品1.000 0 g置于50 mL塑料离心管中，按0.02 mg/kg水平添加10种酰胺类除草剂混合标准溶液，加入5 mL去离子水，涡旋混匀后静置30 min，分别准确加入10.0 mL丙酮、乙酸乙酯、乙腈，加入2 g氯化钠，涡旋振荡2 min，5 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液置于离心管(已加入150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，10 mg GCB)中，剧烈涡旋2 min，5 000 r/min离心5 min，准确移取1.0 mL净化液，40 ℃水浴氮吹至干，准确加入1.0 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm有机滤膜，上机测定目标物的回收率。

1.5.2 净化剂优化 相同的提取条件下，取2 mL上清液，采用3组不同净化组合进行净化，净化组合分别为A(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA)，B(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，10 mg GCB)，C(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，50 mg GCB)，剧烈涡旋2 min，5 000 r/min离心5 min，准确移取1.0 mL净化液，40 ℃水浴氮吹至干，准确加入1.0 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm有机滤膜，上机测定目标物的回收率。

1.6 基质效应评价

取空白黑茶样品，按1.5的方法得到空白基质溶液，并采用空白基质溶液配制基质混合标准工作系列，同时用溶剂配制相同浓度的溶剂标准工作系列，在相同的GC-MS/MS条件下测定得到基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线。按式(1)计算各组分的基质效应[18]。

ME=(B-A)/A×100%，

(1)

式中：

ME——基质效应，%；

A——溶剂标准曲线斜率；

B——基质标准曲线斜率。

1.7 线性范围、检出限和定量限测定

按1.5的方法制备空白基质溶液，并配制质量浓度为0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.500 mg/L的基质混合标准系列工作液，以各组分的峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。在空白黑茶样品中添加低浓度的混合标准溶液，分别以信噪比(S/N)为3和10时的空白样品添加浓度计算方法的检出限和定量限。

1.8 准确度和精密度测定

选取空白黑茶样品进行添加回收试验，添加水平为0.01，0.02，0.10 mg/kg，每个水平平行测定6次，测定10种酰胺类除草剂含量，计算回收率和精密度。

1.9 实际样品的测定

根据最优样品前处理方式处理黑茶样品，在优化的仪器条件下测定黑茶样品中10种酰胺类除草剂含量。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

经全扫描模式获得了10种酰胺类除草剂的保留时间和特征离子，选择离子强度高、质荷比较大的特征离子作为前级离子，采用产物离子扫描模式将各化合物的母离子打碎，并选择2或3个强度大、灵敏度高的离子作为子离子，最后采用MRM 扫描模式，优化所选取子离子的碰撞能量，选出最佳碰撞能量，10种酰胺类除草剂的质谱信息见表1。10种酰胺类除草剂的基质标准溶液MRM色谱图如图1所示，由图1可知，10种酰胺类除草剂可得到有效分离，基质干扰小。

表1 10种酰胺类除草剂的保留时间及多反应监测参数

1. 炔苯酰草胺 2. 二甲草胺 3. 乙草胺 4. 甲草胺 5. 异丙草胺 6. 异丙甲草胺 7. 丁草胺 8. 氟酰胺 9. 吡氟酰草胺 10. 丙炔氟草胺

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂 采用乙腈提取时，10种酰胺类除草剂的回收率均在85%以上，提取效率优于丙酮和乙酸乙酯。选取丙酮或者乙酸乙酯作提取溶剂，色素等杂质较多，提取液颜色较深，不宜净化，基质干扰大，而乙腈提取液颜色相对较浅，基质干扰较小。综合考虑，选取乙腈作为前处理提取溶剂。

2.2.2 净化剂 PSA吸附剂可有效去除提取液中糖类、酚类、脂肪酸及极性色素等成分，C18吸附剂可去除酯类和脂肪等非极性干扰物，GCB可有效去除提取液中的色素。随着净化填料种类的增加，净化液越来越澄清，且随着GCB的引入脱色效果明显，组合A净化后的溶液颜色较深，组合B净化后溶液接近无色，组合C净化后溶液为无色。组合A净化后的溶液中含色素杂质多，对衬管的耗损大，影响色谱柱的使用寿命。组合B净化后各组分的平均回收率最优，为80%～110%(图2)。因此，选取净化组合B作为黑茶中酰胺类除草剂检测的净化剂。

图2 3组净化填料净化后10种酰胺类除草剂的

2.3 基质效应

由图3可知，各酰胺类除草剂组分的基质效应为10%～50%，表明此方法检测黑茶中10种酰胺类除草剂存在明显的基质增强效应，因此使用基质匹配标准曲线法消除基质效应对10种除草剂定量分析的影响，以提高检测结果的准确性。

图3 黑茶中10种酰胺类除草剂的基质效应

2.4 线性关系、相关系数和检出限

由表2可知，10种酰胺类除草剂在0.001～0.500 mg/L内线性关系良好，相关系数(R2)均>0.999；10种酰胺类除草剂的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.001～0.002 mg/kg和0.002～0.008 mg/kg。

表2 黑茶中10种酰胺类除草剂的线性方程、相关系数、检出限、定量限

2.5 方法的回收率和精密度

由表3可知，当加标浓度为0.01 mg/kg时，回收率为80.3%～102.0%，相对标准偏差(RSD)为2.7%～7.3%，当加标浓度为0.02 mg/kg时，回收率为85.1%～103.2%，RSD为1.1%～4.8%，当加标浓度为0.10 mg/kg时，回收率为86.4%～102.3%，RSD为0.9%～5.0%，表明该方法准确度较高，精密度良好，能够满足检测要求。

表3 黑茶中10种酰胺类除草剂的回收率和相对标准偏差

2.6 实际样品测定

采用建立的方法对市售30份黑茶样品进行10种酰胺类除草剂残留量分析，样品品种包括湖南安化黑茶、广西六堡茶、云南普洱茶、四川藏茶、陕西黑茶、湖北青砖茶。经检测所有样品均未检出10种酰胺类除草剂，表明黑茶中检出酰胺类除草剂残留的风险较低。

3 结论

将QuEChERS前处理技术结合GC-MS/MS检测手段，建立了可同时检测黑茶中10种酰胺类除草剂残留量的分析方法。该方法去除黑茶中基质干扰效果好，在0.01，0.02，0.10 mg/kg 3个加标水平下，10种酰胺类化合物的回收率为80.3%～103.2%，方法检出限和定量限分别为0.001～0.002 mg/kg和0.002～0.008 mg/kg。该方法重复性好，精密度高，操作简便、高效，适合于黑茶中酰胺类除草剂的定性和定量检测。后续应完善不同茶叶基质中酰胺类除草剂的检测方法，加大对不同茶叶品种的监测。