LC-LIT-MS法同时检测硬膜外麻醉致死犬体内利多卡因及其代谢物MEGX和GX的研究

张 潮,尉志文,王锦凯,牛卫芬,贠克明

(山西医科大学法医学院毒化教研室,太原 030001;*通讯作者,E-mail:yunkeming4135142@126.com)

利多卡因(lidocaine)又名利多卡因碱、赛罗卡因、昔罗卡因,分子式是C14H22N2O,属于酰胺类碱性中效局麻药,具有弥散广、穿透性强的特点,尤其是其非离子型式对生物膜的穿透力更强,容易发生弥散[1]。在肝脏内经CYP3A2和CYP1A2两种酶代谢生成单乙基甘氨酰二甲苯胺(monoethylglycinexylidide,MEGX)和甘氨二甲基苯酰胺(glycinexylidide,GX)[2],经肾脏排出体外。硬膜外麻醉是我国临床手术常用的麻醉方式,利多卡因则为椎管内麻醉的首选用药之一。手术过程中常会因椎管的特殊解剖生理结构,麻醉医师的操作熟练程度以及病人自身的身体状态等多种影响因素,导致硬膜外麻醉意外的事故时有发生[3,4],硬膜外麻醉意外的法医学鉴定依赖于利多卡因及其代谢物的检测,以及其法医毒物动力学的规律研究[5]。目前在生物检材中能同时检测利多卡因、MEGX和GX的方法还未见报道。本研究旨在通过建立硬膜外注射利多卡因麻醉致死的动物模型[6,7]和LC-LIT-MS检测利多卡因及其代谢产物的方法,为硬膜外麻醉意外的法医学判定提供方法支持。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂

利多卡因标准品(100342-201003)购自中国药品生物制品检定所,地西泮标准品购自公安部物证鉴定中心,MEGX标准品购自北京迪朗生化科技有限公司(N1006),GX标准品(购自美国Sigma公司),以上试剂均配成浓度为10 μg/ml储备液,4 ℃冰箱保存。2%盐酸利多卡因注射液(国药准字H31021071)购自上海朝晖药业有限公司,其余试剂均为色谱纯。

1.2 模型制备

犬6只(山西医科大学实验动物中心提供),体质量(9.6±2.1)kg,雌雄不限,随机分为模型组和空白组,实验前夜禁食,左侧卧位固定于犬台上,剪去实验犬背部胸椎到骶椎处长毛,行腰椎L2-L3间穿刺,穿刺针与脊椎平面成45°,回抽针管有负压且无脑脊液流出,证明穿入硬膜外后,向头侧置硬脑膜导管10 cm,5倍(63.35 mg/kg)[8]硬膜外麻醉极量利多卡因在5 min内缓慢注入。观察并记录实验犬呼吸、心跳等生命体征,至死亡后解剖观察。空白组注入等量生理盐水,1 h后股静脉空气栓塞致死,取心血和肝脏-20 ℃保存用作空白检材。本研究通过山西医科大学伦理委员会审查(编号：2014087)。

1.3 样品处理

分别将肝脏1 g(超声匀浆3 min)、心血1 ml,加蒸馏水2 ml后加安定内标液10 μl,振荡5 min;10%HCl调酸pH=2-3,振荡15 min,3 500 r/min离心6 min,取上清液,用10%NaOH调碱pH=10-12,震荡3 min,加乙醚10 ml,振荡15 min,3 500 r/min离心6 min,取有机层,40 ℃水浴挥干。残渣用500 μl甲醇定容,待检。

1.4 仪器及分析条件

Ultimate 3000双三元梯度液相色谱,LTQ-XL线性离子阱质谱联用仪(美国Thermo fisher),ESI电喷雾离子源和Xcalibur工作站,TOMOS-18R高速冷冻离心机,超声波震荡器。

液相色谱条件:左泵A流动相为超纯水,左泵B流动相为0.1%甲酸的甲醇溶液,左泵C流动相为洗针液(20%超纯水+80%甲醇+0.2%甲酸);右泵A1流动相为缓冲液(0.01 mol/L乙酸铵水溶液+0.1%甲酸),右泵B1流动相为0.1%甲酸的甲醇溶液,右泵C1流动相为超纯水。色谱柱为C18柱(3.0 mm×100 mm,120 Å,2.2 μm),柱温40 ℃。流速0.4 ml/min;进样量50 μl。质谱条件:采用正离子选择监测(SIM)扫描,利多卡因、MEGX、GX测定离子对分别为235/86.1/58,207/122/107和179/122/107,毛细管电压38 V,毛细管温度275 ℃,棱镜电压85 V,鞘气35 arb,辅助气15 arb,碰撞气为高纯氦气,脱溶剂气为高纯氮气,扫描范围m/z:110-500。50 μl进样。

2 结果

2.1 动物表现及解剖所见

经硬膜外注射利多卡因后,实验犬出现心率减慢、流涎、呼吸急促呈腹式呼吸、大小便失禁和抽搐等症状,犬于20 min后死亡。实验犬解剖后可见心脏及大血管内血液不凝呈暗红色无鸡脂样血块形成,肺、肝、肾、脾等器官轻度肿胀,心、肺浆膜面有出血点。解剖见穿刺部位小孔和麻醉导管进入硬膜外的位置(见图1,2),提示造模成功。

图1 实验犬下导管插入椎管位置Figure 1 The location of catheter in model dog

图2 实验犬导管插入硬膜外的位置Figure 2 The location of the duramater catheter in model dog

2.2 质谱图分析结果

在正离子选择监测(SIM)扫描模式出现利多卡因、MEGX及GX的特征离子对,并且离子丰度比均在允许的误差范围内(见图3-8)。

图3 利多卡因标准品质谱图Figure 3 The mass spectrum of lidocaine

图4 利多卡因二级质谱图Figure 4 The secondary mass spectrum of lidocaine

图5 MEGX标准品质谱图Figure 5 The mass spectrum of MEGX

图6 MEGX二级质谱图Figure 6 The secondary mass spectrum of MEGX

图7 GX标准品质质谱图Figure 7 The mass spectrum of GX

图8 GX二级质谱图Figure 8 The secondary mass spectrum of GX

2.3 色谱图分析

染毒心血和肝脏的色谱图中均出现利多卡因、MEGX和GX的色谱峰;LC-LIT-MS总离子流和选择离子色谱图见图9,10。

利多卡因、MEGX和GX的保留时间分别为6.81,6.55,6.43 min图9 硬膜外致死犬血中利多卡因、MEGX和GX的总离子流和选择离子色谱图Figure 9 The total-ion and selected-ion chromatograms of lidocaine, MEGX and GX in poisoned blood

利多卡因、MEGX和GX的保留时间分别为5.73,5.95,5.61 min图10 硬膜外致死犬肝脏中利多卡因、MEGX和GX的LC-LIT-MS总离子流和选择离子色谱图Figure 10 The total-ion and selected-ion chromatograms of lidocaine, MEGX and GX in poisoned liver

2.4 工作曲线

取空白血1 ml和肝组织匀浆1 g各10份,分别加入利多卡因、MEGX和GX标准液0.1,0.5,1,5,10,20,50,100,200,250 ng,内标液10 μl,按1.3项处理,液相色谱-离子肼质谱分析。以样品中利多卡因、MEGX和GX的浓度为Y轴,与内标峰面积比值为X轴,进行线性回归,得到相关系数、检出限和响应范围,结果均能够满足定量检测的要求(见表1)。

表1 利多卡因、MEGX和GX的工作曲线

2.5 方法回收率

取空白血1 ml和空白肝脏1 g各3份,分别加入4 ng、20 ng、50 ng利多卡因、MEGX和GX,按1.3样品处理后进样,测定结果见表2和表3,回收率偏差均小于15%,方法稳定性好。

表2 利多卡因、MEGX和GX在心血中的回收率 (n=3,%)

表3 利多卡因、MEGX和GX在肝脏中的回收率 (n=3,%)

3 讨论

法医毒物动力学(forensic toxicokinetics)[5]是运用法医毒理学和法医毒物动力学理论和技术探究机体、尸体、检材和自然环境中法医毒物的动力学变化过程的一门学科。其研究内容主要包括毒物的毒物动力学、死后分布、动态分布、死后再分布、死后弥散、分解动力学、检材和尸体中毒物的死后产生情况等,为中毒案件的法医学鉴定提供毒物动力学证据。

本实验建立了硬膜外麻醉致死犬体内利多卡因及其代谢物MEGX和GX的LC-LIT-MS检测方法,样品处理简单方便,重复性好,目标物色谱峰分离良好,检出限低,回收率高;可用于对利多卡因及其代谢物的法医毒物动力学研究,以及利多卡因麻醉意外和相关中毒案件的法医学鉴定。