抑制miR-214对七氟醚麻醉后新生小鼠学习认知能力的影响及机制

张祎明,宋 阳,高 扬,张 静,韩玉琴

(承德市儿童医院麻醉科,承德 067000;*通讯作者,E-mail:zhangyimingcd@yeah.net)

七氟醚是外科手术中常用的吸入麻醉剂,因其气道刺激性小、麻醉过程平稳、苏醒迅速等特点,广泛应用于新生儿、婴幼儿的手术麻醉[1]。妊娠后期至出生后6个月是人类大脑发育的高峰期[2]。既往研究表明,新生儿早期多次暴露于七氟醚与其学习认知功能障碍有关[3-5]。目前研究发现,七氟醚对学习认知功能障碍的影响可能与其诱导海马区一些基因的改变从而降低海马神经元的再生和存活有关,但具体机制尚不清楚[6,7]。

微小RNA(miRNAs)是一类小的非编码RNA,由22-25个核苷酸组成,存在于所有真核生物中,参与细胞生命活动的调控[8]。研究显示miRNA介导的基因调控与神经精神功能障碍有关[9,10]。近期叶济世等[11]通过miRNA微流体芯片分析显示,miR-214在七氟醚吸入麻醉的新生大鼠海马组织中表达明显上调,可能与七氟醚吸入麻醉诱发的新生大鼠的发育期神经毒性有关。至今,miR-214对七氟醚吸入麻醉诱发的新生儿学习认知能力的影响及作用机制尚不明确。因此,本研究旨在探讨miR-214在七氟醚麻醉后新生小鼠海马区的表达变化,并进一步观察抑制miR-214对七氟醚麻醉后新生小鼠学习认知能力的影响和可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

七氟醚购自日本Maruishi公司;antagomiR-NC、antagomiR-214及PCR引物购自上海吉玛制药公司;TUNEL(绿色荧光)细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天公司;IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物公司;Trizol购自美国Invitrogen公司;逆转录cDNA试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自日本TAKARA公司;一抗p-PI3K、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司;HPR偶联的二抗购自英国Abcam公司。

1.2 实验动物分组及处理

6日龄健康雄性C57BL/6小鼠64只,SPF级,体质量3-5 g,购自北京维通利华实验动物技术公司。所有小鼠随机分为对照组、七氟醚组、七氟醚+antagomiR-NC组、七氟醚+antagomiR-214组,每组16只。对照组不给予七氟醚暴露,余三组均给予七氟醚暴露。七氟醚暴露模仿临床麻醉状态[12]:首先3.5%七氟醚麻醉30 min后,再采用3%七氟醚麻醉30 min,最后用2.5%七氟醚麻醉30 min,共1.5 h。七氟醚+antagomiR-NC组和七氟醚+antagomiR-214组在七氟醚暴露前24 h分别给予尾静脉注射抑制物阴性对照antagomiR-NC(80 mg/kg)和miR-214抑制物antagomiR-214(80 mg/kg),七氟醚组给予尾静脉注射等体积生理盐水。待麻醉结束后,每组随机选取8只小鼠颈椎脱臼法处死取得海马组织进行检测;每组剩余8只小鼠于麻醉结束后继续培养至性成熟期(出生后第60天)行Morris水迷宫实验。本研究经医院伦理委员会批准,遵循实验动物操作的3R原则。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 TUNEL实验检测海马区神经元细胞凋亡 取小鼠海马组织,4%的多聚甲醛固定24 h后,石蜡包埋,经冠状平面制作5 μm厚连续组织切片,参考幼鼠脑解剖图谱,每只小鼠选择5个相同的海马区平面切片进行TUNEL染色,切片常规脱蜡至水,加入20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K溶液后,37 ℃反应15 min,PBS洗涤3次后,加入TUNEL检测液37 ℃避光孵育60 min,加含荧光素抗体,37 ℃避光孵育30 min,荧光显微镜下观察并计算单位面积内TUNEL阳性细胞数。

1.3.2 ELISA法检测海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 取小鼠海马组织进行组织匀浆,4 ℃离心后收集上清液,应用IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒测定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度水平。

1.3.3 qRT-PCR检测海马组织中miR-214的表达 取小鼠海马组织,应用Trizol试剂提取组织总RNA,参照逆转录cDNA试剂盒说明书操作逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板,加入PCR引物,参照qRT-PCR试剂盒说明书步骤操作进行qPCR扩增反应。miR-214引物序列,正向:5′-TATACATCA AACAGCAGGCACA-3′,反向:5′-CATTCGATCTTCTCCACAGTCTC-3′;内参U6引物序列,正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件:94 ℃ 60 s,92 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,76 ℃ 30 s,进行42个循环。采用2-ΔΔCt法计算海马组织中miR-214的相对表达水平。

1.3.4 Western blot法检测海马组织中p-PI3K蛋白的表达 取小鼠海马组织,加入RIPA裂解液提取海马组织总蛋白,并应用BCA法进行蛋白定量。各组取50 μg蛋白上样,然后行10% SDS-PAGE电泳,采用半干法将蛋白转移至PVDF膜,洗膜3次,加入5%脱脂牛奶中封闭1 h,加入一抗p-PI3K(工作浓度1 ∶1 000)和GAPDH一抗(工作浓度1 ∶2 000),4 ℃孵育一抗过夜,洗膜3次,次日加入HPR偶联的二抗后室温孵育1 h,经LI-COR Odyssey成像分析系统扫描、拍照并分析条带灰度值。

1.3.5 Morris水迷宫实验检测小鼠认知功能 取性成熟期(出生后第60天)的各组剩余小鼠进行Morris水迷宫实验,Morris水迷宫为高50 cm、直径150 cm、深25 cm的黑色圆柱形水池,水池平均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限。实验时,首先在水桶内加入氧化钛使水变成不透明的乳白色,在水池第Ⅰ象限中央放置一个直径6 cm的圆形隐藏平台,低于水面1 cm,实验时,水温保存在25 ℃,水池周围的参照物保持不变,实验前一天将小鼠放入没有平台的水池中自由游泳120 s适应水池环境。①定位航行实验:将小鼠从水池不同的象限面向池壁放入水池,记录小鼠找到平台的时间记为逃避潜伏期,连续进行5 d,4次/d,取平均值;②空间探索实验:定位航行实验结束后第2天进行空间探索实验,撤除圆形隐藏平台,以第Ⅳ象限作为小鼠入水点,记录小鼠120 s时间内穿越原平台象限(第Ⅰ象限)的次数及原平台象限的停留时间。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠海马组织神经元细胞凋亡情况比较

与对照组比较,七氟醚组小鼠海马区TUNEL阳性细胞数显著增多(P<0.05)。七氟醚组与七氟醚+antagomiR-NC组小鼠海马区TUNEL阳性细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与七氟醚+antagomiR-NC组比较,七氟醚+antagomiR-214组小鼠海马区TUNEL阳性细胞数显著减少(P<0.05,见表1,图1)。

表1 各组小鼠海马神经元细胞凋亡及miR-214、PTEN蛋白的相对表达水平比较

图1 TUNEL实验检测小鼠海马区神经元细胞凋亡Figure 1 Apoptosis of hippocampal neurons in mice by TUNEL assay

2.2 各组小鼠海马组织中miR-214、p-PI3K蛋白表达水平的比较

与对照组比较,七氟醚组小鼠海马组织中miR-214的相对表达显著升高(P<0.05),而p-PI3K蛋白的相对表达水平明显降低(P<0.05)。七氟醚组与七氟醚+antagomiR-NC组小鼠海马组织中miR-214和p-PI3K蛋白的相对表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与七氟醚+antagomiR-NC组比较,七氟醚+antagomiR-214组小鼠海马组织中miR-214的相对表达水平显著降低(P<0.05),而p-PI3K蛋白的相对表达水平显著升高(P<0.05,见表1,图2)。

1.对照组;2.七氟醚组;3.七氟醚+antagomiR-NC组;4.七氟醚+antagomiR-214组图2 Western blot检测小鼠海马组织中p-PI3K蛋白的表达Figure 2 Expression of p-PI3K protein in mouse hippocampus by Western blot

2.3 各组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平比较

与对照组比较,七氟醚组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)。七氟醚组与七氟醚+antagomiR-NC组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与七氟醚+antagomiR-NC组比较,七氟醚+antagomiR-214组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05,见表2)。

表2 各组小鼠海马组织中IL-1β、TNF-α和IL-6水平的比较

2.4 各组小鼠逃避潜伏期及空间探索实验结果比较

与对照组比较,七氟醚组小鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.05),而穿越原平台象限的次数明显减少(P<0.05),原平台象限的停留时间明显缩短(P<0.05)。七氟醚组与七氟醚+antagomiR-NC组小鼠逃避潜伏期、穿越原平台象限的次数及原平台象限停留的时间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与七氟醚+antagomiR-NC组比较,七氟醚+antagomiR-214组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),而穿越原平台象限的次数明显增多(P<0.05),原平台象限停留的时间明显延长(P<0.05,见表3)。

表3 各组小鼠逃避潜伏期及空间探索实验结果的比较

3 讨论

未成熟大脑是神经发育的关键期,近年来动物实验表明,吸入性麻醉药能够对未成熟大脑造成不同程度的损伤从而产生认知学习功能障碍,其机制可能与吸入麻醉可导致神经元细胞发生凋亡,从而影响正常神经网络的构建有关[13,14]。海马区是由中间脑皮质分化,被公认是认知记忆学习中至关重要的脑区。研究显示吸入性麻醉药造成发育关键期大脑海马区基因的改变是产生认知学习功能障碍的关键因素[15,16]。miRNA是近年来发现的参与机体生命活动调控的非编码小分子RNA,研究显示海马区miRNA的异常改变是吸入性麻醉药造成新生儿产生认知学习功能障碍的关键因素[17]。

miR-214近期发现的miRNA家族重要的成员之一,在机体细胞生长、凋亡、炎症、免疫调控、肿瘤发生等方面均发挥着极其重要的作用[18,19]。近期研究发现miR-214与神经损伤的再生有关[20]。miR-214能够调节神经元细胞的分化,抑制神经突起的生长[21]。Mellios等[22]发现野生型小鼠胚胎脑中高表达的miR-214能够干扰神经发生和神经元的迁移。近期miRNA微流体芯片分析研究显示miR-214在七氟醚麻醉的新生大鼠海马组织中表达明显上调,但具体作用机制尚不清楚[11]。本研究中选用6日龄SPF级雄性健康C57BL/6小鼠作为研究对象,模仿临床麻醉状态给予七氟醚暴露,结果发现七氟醚组小鼠海马TUNEL阳性细胞数明显增多,性成熟期后逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少,提示临床麻醉状态下七氟醚的暴露能够造成小鼠海马区神经元细胞的凋亡增加,认知记忆功能障碍,与既往研究结果一致[11,23]。并且本研究发现七氟醚组小鼠海马组织中miR-214的表达明显升高,提示异常增高的miR-214可能与七氟醚对新生小鼠海马神经元细胞凋亡增加有关。进一步本研究通过尾静脉antagomiR-214抑制小鼠海马组织miR-214的表达,结果发现抑制miR-214能够明显减少小鼠海马区神经元细胞的凋亡,缩短逃避潜伏期,增加穿越原平台象限的次数,延长原平台象限停留的时间,提示抑制miR-214能够减轻小鼠海马区神经元细胞的凋亡,从而减轻认知记忆功能障碍。

PI3K信号通路机体一种重要的细胞存活信号通路,在神经系统也广泛存在,参与神经元细胞的分化、增殖、凋亡等过程[24]。PI3K信号通路的激活能够抑制炎症反应从而减轻神经损伤[25,26]。本研究结果发现,七氟醚吸入暴露能够抑制新生小鼠海马区p-PI3K蛋白的表达,增加海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,说明七氟醚吸入暴露能够抑制PI3K信号通路的激活,增加海马区的炎症反应,从而造成海马区神经元细胞的凋亡。龚涛武等[27]也在研究中发现相同的结论。既往研究发现miR-214能够调控PI3K信号通路参与机体重要生命活动的调控[28,29]。本研究中我们发现通过尾静脉antagomiR-214抑制小鼠海马组织中miR-214的表达,能够明显升高p-PI3K蛋白的表达水平,提示抑制miR-214减轻七氟醚致新生小鼠海马区的炎症反应和认知功能的损伤,可能与miR-214对PI3K信号通路的调控有关。

综上所述,七氟醚可造成新生小鼠认知功能损伤及海马组织中miR-214的升高。抑制miR-214能够减轻七氟醚致新生小鼠海马区的炎症反应从而减轻小鼠认知功能的损伤,其机制可能与其对PI3K信号通路的调控有关。