黄芩苷对心肌梗死模型大鼠心肌细胞及其免疫功能的影响

翟晓艳,杨李旺,杨 蓉,赵焕新,季新艳,周儒奎

(1山西中医药大学解剖教研室,太原 030016;2山西中医药大学药理教研室;3山西中医药大学生理教研室)

近年来,世界各国的心血管疾病的发病率呈上升趋势,其中冠心病率约为50%,已严重影响全人类的生命健康[1]。冠心病中心肌梗死作为常见的严重类型,病发期间多伴有免疫功能紊乱,严重影响患者的心功能以及缺血病程进展。因此,适当的免疫调节剂可能为治疗相关疾病开辟一条药物介入途径。陈玲玲等[2]研究黄芩苷预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠,发现其能抵抗更长时间的以上损伤,储备更强的内源性抗氧化损伤能力。此外,黄浪等[3]研究显示,黄芩苷可改善心功能,抑制心肌细胞凋亡,机制可能与其降低内质网应激因子表达有关,但他们均没有深入分析相关的心肌组织蛋白损失机制及其对细胞凋亡率与免疫功能的影响。临床上寻找新的防治药物或方案仍是研究的热点问题。现代药理学研究表明,中药黄芩苷已在各种心血管疾病治疗中发挥重要的作用,表现出抗炎、免疫调节以及保护心肌细胞的作用[4]。本研究深入分析了黄芩苷药理作用的疗效,系统研究黄芩苷作用的可能机制,为中药学应用于相关的心血管疾病提供了坚实的实验基础和理论科学资料。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

机将24只SD大鼠(南京君科生物工程有限公司，体质量230-250 g)分为假手术组、模型组与黄芩苷组，每组8只。其中假手术组采用丝线穿至左前降支根部，但不结扎，模型组、黄芩苷组大鼠采用结扎大鼠冠状动脉左前降支近端的方法进行建模。

1.2 建立心肌梗死模型

SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉,颈部去毛,分离气管,连接麻醉呼吸机,连接心电图导联,开胸后进行辅助呼吸,暴露心脏,5/0号细线结扎冠状动脉左前降支起始端,并快速放回胸腔,排气,闭胸。造模当天开始灌胃，1次/d， 持续30 d，其中假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，黄芩苷组给予100 mg/kg黄芩苷(上海纯优生物科技有限公司,CAS:21967-41-9)。

1.3 心功能状况

采用彩色多普勒超声心动图(美国Acuson SEQUOIA 521)评估各组大鼠心功能指标心率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)及左心室收缩压(LVSP)情况。

1.4 苏木素-伊红(HE)染色检测组织形态学变化

采用颈部脱臼法处死大鼠,提取部分心脏,采用4%甲醛缓冲液固定,进行切片、脱蜡、乙醇水合处理、染色(碧云天提供的试剂盒)、封片,最后光镜下观察心肌组织形态学。

1.5 细胞凋亡的检测

采用TUNEL法严格根据试剂盒步骤检测大鼠心肌细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。

1.6 蛋白免疫印迹法检测心肌组织蛋白表达

采用化学发光显影测定、拍照,借助自带软件分析大鼠心肌组织中蛋白酶激活受体2(PAR-2)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)蛋白的表达水平。使用蛋白裂解液裂解粉碎的大鼠心肌组织,提取总蛋白,行10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜,封闭。加入(PAR-2、Bcl-2、Bax抗体,以TBS稀释,浓度分别为1 ∶500,1 ∶500,1 ∶200)一抗,置于4 ℃孵育过夜;加入二抗,室温下孵育1 h。其中,β-actin为内参照检测PAR-2表达水平,GAPDH为内参照检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平。半定量结果为目的条带与内参照条带吸光度比值。

1.7 免疫功能

采集大鼠颈动脉血,采用流式细胞仪(美国贝克曼DxFLEX型)检测T淋巴细胞亚群(CD3、CD4、CD8、CD4/CD8)水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠心功能指标LVSP、LVEDP和HR比较

三组间大鼠的HR比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠心功能指标LVSP明显降低,LVEDP明显提高(P<0.05);与模型组比较,黄芩苷组大鼠心功能指标LVSP明显升高,LVEDP均明显降低(P<0.05,见表1)。

表1 三组大鼠心功能指标LVSP、LVEDP与HR比较

2.2 三组大鼠心肌组织蛋白Bcl-2、Bax、PAR-2表达水平比较

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织蛋白Bax、PAR-2均明显提高,Bcl-2明显降低,差异有统计有意义(P<0.05);与模型组比较,黄芩苷组大鼠心肌组织蛋白Bax、PAR-2均明显降低,Bcl-2明显提高,差异有统计有意义(P<0.05,见表2与图1)。

表2 三组大鼠心肌组织蛋白Bcl-2、Bax、PAR表达水平比较

图1 三组大鼠心肌组织蛋白Bcl-2、Bax、PAR表达水平的蛋白免疫印迹Figure 1 Expression levels of Bcl-2, Bax and PAR in myocardial tissues of rats in three groups by Western blot

2.3 三组大鼠免疫功能淋巴细胞总数及亚群变化比较

与假手术组比较,模型组大鼠CD3+、CD4+、CD8+均明显提高,而CD4+/CD8+明显降低,差异有统计有意义(P<0.05);与模型组比较,黄芩苷组CD3+、CD8+明显降低,CD4+/CD8+明显提高,差异有统计有意义(P<0.05),黄芩苷组CD4+比较稍微上升,但差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。

表3 三组大鼠免疫功能淋巴细胞总数及亚群变化比较

2.4 三组大鼠心肌细胞凋亡率比较

模型组大鼠的心肌细胞凋亡率明显高于假手术组,差异有统计有意义(P<0.05);黄芩苷组大鼠心肌细胞凋亡率明显低于模型组,差异有统计有意义(P<0.05,见表4)。

表4 三组大鼠心肌细胞凋亡率比较

2.5 三组大鼠心肌组织病理学HE染色比较

与假手术组比较,模型组大鼠心肌细胞显著损伤,心肌纤维排列紊乱,部分出现断裂、分离;与模型组比较,黄芩苷组大鼠损伤的心肌细胞数量显著减少,心肌细胞呈现较小但排列较规则,心肌纤维较完整,心肌组织病理损伤程度显著减轻(见图2)。

图2 三组大鼠心肌组织病理学HE染色 (×50)Figure 2 Histopathological changes of myocardium of rats in the three groups by HE staining (×50)

3 讨论

急性心肌梗死已经成为对人类生命安全产生严重影响的主要疾病之一。一些研究表明,心肌细胞在不断的缺血、缺氧以及缺血再灌注过程中不仅出现细胞损伤、坏死,还会引起心肌细胞凋亡,对心功能产生严重的影响[5,6]。基因调控的细胞凋亡在心肌梗死疾病中心肌细胞凋亡路径相关基因表达水平高低存在直接的关联。但是在不同的因素作用下,机体可能存在不同的调控基因来诱导心肌细胞凋亡,因此传导细胞凋亡通路可能存在多条,但是这些通路之间保持着一定的相互作用与关联[7,8]。一旦机体启动细胞凋亡,机体会通过细胞内酶促级联反应显著地改变细胞形态,同时调控相关的生化指标水平高低,从而影响细胞凋亡状态[9]。发生心肌梗死后,缺血性应激作用会诱导梗死边缘的心肌细胞凋亡数量显著上升,导致心室重构,严重者发生心力衰竭,因此临床治疗心肌梗死疾病通过降低心肌细胞凋亡率来提高患者生存率的意义重大。

黄芩苷药理作用在近年来陆续被开发与研究,主要表现在抗氧化、抗炎、抗过敏等方面,同时具有保护机体的免疫系统等[10,11]。近年关于黄芩苷在心、脑血管系统作用的实验研究日益增多,王震雨等[12]研究显示,野黄芩苷减轻脑缺血损伤的作用主要是促进了新血管的生成。欧红令等[13]研究表明,病毒性心肌炎小鼠给予黄芩苷灌胃可抑制心肌细胞凋亡,其机制可能是通过抑制Cyt C/Caspase-9/Caspase-3凋亡信号通路表达与活化,进而提高心肌细胞线粒体膜电位,减轻线粒体损伤,从而改善病毒性心肌炎。此外,免疫细胞因子异常升高不仅会抑制心肌细胞功能,还会导致心肌损伤、心肌重构等[14]。许多研究显示,心肌缺血或心力衰竭患者的CD4+/CD8+值会明显低于正常健康者,同时免疫功能也较低,且与疾病的严重程度存在正相关性[15,16]。而本研究采用的黄芩苷对机体的免疫系统具有调节作用,结果显示黄芩苷治疗大鼠的CD4+/CD8+值与病理模型大鼠存在明显的差异,但与正常大鼠较接近,这提示黄芩苷可以改善心肌梗死疾病的免疫功能。

PARP-1具有调控细胞生长、凋亡等作用,在生物细胞中分布较多,而PAR-2是其活性形式之一[17]。此外,机体内调控细胞凋亡会存在如凋亡抑制因子与诱导因子等因子参与细胞生理过程[18]。Bcl家族中,Bax是Bcl-2的同源体,而促凋亡因子Bax与抑制凋亡因子Bcl-2等均参与细胞凋亡通路的调节,其中抑制Bcl-2会诱使细胞加速凋亡。对于Bax促进细胞凋亡可能机制为:Bax会促进细胞凋亡,同时抑制同源体Bcl-2作用,降低细胞色素C水平,加速细胞凋亡[18,19]。此外,凋亡抑制基因Bcl-2抑制多种因素诱导的细胞凋亡,也会降低缺血再灌注心肌细胞的凋亡率[19]。本研究结果显示,与心肌梗死模型大鼠比较,黄芩苷可以明显降低心肌梗死模型大鼠心肌组织蛋白Bax、PAR-2表达水平,提高Bcl-2表达水平,以及心功能指标LVSP、LVEDP均明显改善,这提示其有助于抑制心肌细胞凋亡路径与心功能机能,同时本研究也显示心肌细胞的凋亡率明显降低,以上结果综合表明黄芩苷有助于改善心肌梗死的病情,减轻心肌损伤,保护心功能的作用。

综上所述,黄芩苷有助于改善心梗疾病心功能,降低心肌细胞凋亡率,同时改善心肌组织的免疫功能,可能作用机制为上调Bcl-2、PAR-2蛋白水平,下调Bax蛋白表达,抑制心梗后心肌细胞凋亡率,发挥保护心肌细胞的作用。