基于基因测序的地下咸水微生物多样性研究

桑石磊， 黄柏强

(生态环境部 华南环境科学研究所， 广东 广州 510535)

许多沿海城市都受到地下水咸化作用的影响，其诱发因素多种多样，包括生活和工业废水[1]、古海水[2]及现代海水入侵[3]等。为了探明地下水盐分的来源以及地下水盐渍化对人类生活和生态系统的影响，已经有一些学者对海水入侵区域的水文地球化学过程和微生物群落的变化进行研究[2-4]。有研究表明，海水入侵作用引起地下水的污染和微生物群落发生变化[5-6]。然而，由于地下生态系统犹如“黑盒子”的复杂性，地下水微生物的多样性和群落尚未得到充分研究。微生物是地下水生态环境的唯一栖息者，将近1/2的原核生物都藏在地下，驱动着很多重要生源要素的生物地球化学循环，与营养物质的运输、物质转换和污染物的降解密切相关。许多含水层的环境条件(温度、pH、水化学和流速)几乎是稳定的，微生物群落不受地表的直接影响。因此，研究地下微生物群落结构对有效认识地下水和更好地利用和保护地下水具有非常重要的理论意义和实践价值。近年来，随着分子微生物学及其相关技术的快速发展，目标DNA的鉴定和定量分析解决了利用微生物学进行地下环境微生物研究存在的难题[7]。HEEJUNG等[8]综合水文地质学、分子微生物学和同位素分析方法，研究微生物群落结构与地球化学过程的相互作用认为，多学科综合研究是追踪污染源和微生物过程的有效工具。笔者近年来参与海水入侵相关的研究项目，对珠江三角洲地区和北莱州湾地区地下水的水文化学、微生物群落多样性特征进行长期的研究，取得一些与地下水环境监测、环境影响因素等相关的研究成果。为进一步研究地下咸水微生物群落的多样性特征提供参考，基于高通量测序技术，研究珠江三角洲地区和莱州湾地区地下咸水区微生物的多样性。

1 材料与方法

1.1 材料

选取莱州湾地区50余口民用井(图1)，待水体流出一段时间后用干净的塑料桶取水体10 L；在广州南部地区选取12口地下水监测井，采集水体5 L，用0.22 μm滤膜过滤收集水体样品。

图1 民用井采样点的位置分布

1.2 方法

1.2.1 海水入侵对民用饮水井咸水区微生物群落的影响 以电导率>1 500 μS/cm作为海水入侵的标准，调查50余口民用井水体的理化性质，温度、pH、水位、电导率等指标使用电导率仪现场测试，其余理化因子在室内分析测试。选取其中5口典型的监测井，过滤水样得到微生物样品，经过DNA的提取和高通量测序，分析微生物的种类和多样性。

1.2.2 珠三角咸水区的微生物群落组成 研究珠江三角洲地下咸水区微生物群落的多样性特征，以广州南部地区采集的12个地下水监测井水样为研究对象，采用高通量测序技术，经过DNA的提取和高通量测序，分析微生物的种类和多样性。

1.2.3 不同咸水区微生物的异同 根据DNA测序结果，比较研究南方和北方不同的海水入侵地区微生物群落的相似性和差异性。

2 结果与分析

2.1 海水入侵对民用饮水井咸水区微生物群落的影响

调查50余口民用井水体的理化性质发现，高达70%的民用井受到海水入侵的影响，最高的电导率值为8 390 μS/cm，平均值为2 300 μS/cm。经过对5口典型监测井水样过滤得到的微生物样品的DNA提取和高通量测序发现，海水入侵作用对饮用水体中主要的离子浓度有一定的影响，且影响微生物的多样性和群落结构。不同盐度水体中高丰度的微生物类型不同，在淡水中主要是β-变形菌，在微咸水中主要是拟杆菌属和红细菌属，而在咸水中是Perlucidibaca。此外，在咸水水体中的一些菌群，如假单胞菌属和黄杆菌属，容易在水体中形成菌膜，有助于致病菌的生存和繁殖[9]。

2.2 珠三角咸水区微生物的群落组成

从图2看出，珠江三角洲地下咸水区微生物群落的多样性特征。门的水平：地下水中的微生物类群主要包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和Woesearchaeota。纲的水平：丰度较高的是γ-变形菌纲和厚壁菌门的芽孢杆菌纲。属的水平：有微小杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、食酸菌属、甲烷球菌、脱硫弧菌属和丛毛单胞菌属等。其中，厚壁菌门能够产生孢子抵抗不利的环境条件，采样区有大量厚壁菌门的微生物存在，表明，广州咸水入侵区地下水环境对微生物的生存而言不是一个适宜的生态环境，可能与广州地下水中存在大面积的高盐度环境及其他的环境污染源有关。还有拟杆菌门的微生物存在，其可以降解有机物质，对地下水环境的自然净化过程非常重要。然而微生物降解污染物的过程比较缓慢，而且不能超过一定的限度，还需要比较适宜的环境，拟杆菌门只在一些地区出现，可能是地下咸水环境限制了此类群微生物的大量繁殖与扩散。

图2 微生物群落结构门水平上的分类

有研究显示[10]，该地区地下环境中存在大量的海侵时期的古生物沉积层，在源源不断释放盐分的同时，也释放了大量的有机物，从而使得高咸水区微生物的多样性较高。此外，由于降雨和地表水的补给，对地下咸水有稀释作用，在一些补给频繁的地区，造成地下环境的盐度波动较大，对微生物的生长不利，从而可能导致该地区微生物多样性较低。比较不同盐度梯度下微生物群落的组成特征发现，中度咸水和微咸水的OTUs比高盐度的地下水样品更相似；而不同盐度的样品有很多共享的OTUs，说明，淡水和盐水之间有强烈的交换。影响地下水微生物群落的主要环境因子包括盐度、pH和总氮。

2.3 不同咸水区微生物的异同

对比珠江三角洲和莱州湾地区不同海水入侵地区微生物群落的相似性和差异性(图3)发现，地下水主要的细菌类群有很大的相似性，主要的类群均为变形菌门的γ-，β-和α-变形菌纲以及厚壁菌门的芽孢杆菌纲。但不同地区其他细菌类群组成存在一定差异，如在莱州湾地下水体中放线菌纲、拟杆菌纲和鞘脂杆菌纲的丰度比较高，而在珠江三角洲地下水中ε-、δ-变形菌纲丰度比较高。不同地区之间的差异是由多种因素共同作用引起的，如地质构造、周围环境及地下水流动性等，其对微生物群落也会产生影响。此外，在咸水区检测到的一些微生物类群，如交替单胞菌目(Alteromonadales) 、海杆菌属 (Marinobacter)和海洋螺菌目(Oceanospirillales)等，可以作为潜在的海水入侵的标志性物种，为咸水区的微生物监测指示提供了研究方向。

图3 珠江三角洲(a)和莱州湾地区(b)不同海水入侵地区地下水微生物群落纲水平上的比较

3 小结

研究基于高通量测序技术对比了珠江三角洲(南方)和莱州湾地区(北方)不同海水入侵地区微生物群落的相似性和差异性，结果表明：莱州湾地区50余口民用井中70%的民用井受到海水入侵的影响，最高电导率为8 390 μS/cm，平均为2 300 μS/cm；不同盐度水体中高丰度的微生物类型存在差异，淡水中主要是β-变形菌，微咸水中主要是拟杆菌属和红细菌属，而咸水中主要是Perlucidibaca。珠江三角洲地下咸水区微生物群落丰度较高的门、纲和属分别是变形菌门、厚壁菌门及奇古菌门等7个门，γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲2个纲，微小杆菌属、假单胞菌属及不动杆菌属等8个属。2个地区地下水微生物群落结构有很大的相似性，主要类群均为变形菌门的γ-，β-和α-变形菌纲以及厚壁菌门的芽孢杆菌纲；也存在一定的差异，莱州湾地下水体中以放线菌纲、拟杆菌纲和鞘脂杆菌纲的丰度比较高，珠江三角洲地下水体中以ε-、δ-变形菌纲丰度较高。一些微生物如交替单胞菌目等，可以作为潜在的海水入侵标志性物种，表明微生物群落在不同海水入侵地区的环境指示意义。