闽楠叶斑病病原菌的分离鉴定及其生物学特性

姚 英， 于 存

(贵州大学 林学院， 贵州 贵阳 550025)

闽楠(Phoebebournei)俗称楠木，属樟科(Lauraceae)楠属(Phoebe)常绿大乔木，是我国特有物种，为国家二级保护植物，分布于福建、江西、湖南、广西、广东、贵州、浙江和湖北等地[1]。其材质通直并带有特殊香味，纹理精美，广泛用于建筑、家具、雕刻行业和精密木模的制作。同时，楠木冠大荫浓，树姿优美，是优良的园林绿化树种[2]。此外，闽楠还有净化空气、隔音降噪和杀菌驱虫等生态功能，广泛用于香料提取及化妆品研发领域[3]。由于野生资源过渡采伐，导致楠木濒临灭绝，现已开始大量人工栽植[4-5]，但其种植过程中常伴有多种病虫害的发生，尤其是叶斑病已成为闽楠叶部的主要病害之一，且遍布各闽楠育苗基地及幼龄林分布区。闽楠叶斑病染病初期受害部位出现红褐色圆形斑点，向外扩展，由许多小病斑块融合成不规则的大斑，最后导致叶片退绿，严重致其死亡。炭疽菌属(Colletotrichumspp.)是主要的植物致病菌和病原菌，分布广、寄主多，可危害谷物、水果蔬菜和核桃等多种农林植物，对农林业生产威胁极大[6]。胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是炭疽菌属的重要种类，可引起橡胶、芒果和香蕉等多种植物炭疽病[7]，C.gloeosporioides具有集合种和复合种的特点，种内菌株间变异大，有数个专化型或生理小种[8]。目前，在闽楠上已发现小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)可引起叶斑病[9]。笔者在调查闽楠病害时发现，除P.microspora可引起闽楠叶斑外，还有其他病原菌可引起闽楠叶斑病。因此，探明引起某一植物病害的胶孢炭疽菌生物学特性，明确其引发病规律和发病特点，对该原菌引起的植物病害的防治具有重要意义。从贵州省都匀市螺丝壳自然保护区采集闽楠典型叶斑病病叶，对其进行病原菌的分离与鉴定，探明其生物学特性，以期为闽楠叶斑病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

闽楠典型叶斑病病叶样品共计30片，采自贵州省都匀市螺丝壳自然保护区。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离 采用常规组织分离法分离闽楠叶斑病病原菌，首先用1%次氯酸钠进行叶片表面消毒3～5 min，后用无菌水清洗3～5次，无菌条件下，剪取病健交界处约3 mm×3 mm的组织放置在PDA平皿，每个平皿放置3块病组织，每个叶片3次重复，30个叶片共90个处理。之后将样品于(25±2) ℃条件下培养，当样品边缘生长出菌丝时及时挑取边缘菌丝尖端转移至新的PDA平皿中进行菌株纯化，直至获得纯化菌株。获取真菌菌株后根据菌落、菌丝和孢子特征进行合并，确定主要种类后统计不同真菌的分离率。

分离率=某一真菌分离个数/所有真菌分离个数×100%

1.2.2 病原菌的致病性测定 随机选取分离得到的相同种真菌菌株5株按照柯赫氏法进行离体叶片的回接。将20年生闽楠健康叶经75%酒精表面消毒后，用无菌昆虫针轻轻刺伤表面，用打孔器截取直径为0.5 cm真菌菌饼置于刺伤部位，用湿脱脂棉保湿，25℃恒温培养10 d，观察不同真菌是否引起闽楠叶片叶斑的症状。选择回接后产生明显叶斑病的叶片，由发病的病健交界处，利用组织分离法再次分离病原菌，利用形态学方法比较再分离菌株与原接种菌株形态特征是否一致，以上每个真菌离体回接20片叶。

1.2.3 病原菌的鉴定

1) 形态学鉴定。将回接引起闽楠叶斑的病原菌接种至PDA平板上，于25℃暗培养5 d，培养过程中观察菌落颜色、形状、气生菌丝的疏密程度等形态特征，并采用插片法获取病原菌菌丝和孢子，观察记录菌丝和孢子的分支及大小，参照陆家云的方法进行病原菌的形态学鉴定[10]。

2) 分子学鉴定。在PDA平板上活化闽楠叶斑病病原菌，利用接种钩刮下平板上生长的菌丝体用于病原菌基因组的提取。病原菌基因组提取采用CTAB法，用真菌ITS通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCT-CCGCTTATTGATATGC-3′)扩增病原菌的目的基因序列。PCR反应体系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L d NTP 2 μL、Taq 酶0.2 μL、模板 DNA 1 μL、25 μmol/L引物ITS1和ITS4各0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR 扩增条件：95℃预变性4 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物的纯化和序列测定委托重庆擎科生物技术有限公司进行，所得到的核苷酸序列进行在线NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比对分析，应用MEGA 7.0中的临近法(Neighbor-joining，NJ)构建病原菌ITS的系统进化树，系统进化树构建过程中采用Bootstrap法进行检验，重复计算1 000次后确定菌株的分类地位。

1.2.4 不同因素对病原菌菌丝体生长的影响

1) 培养基。供试培养基有水琼脂(WA)培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基、PDA+维生素B6(PDA+VB 6)培养基、PDA+楠木煎汁(Ph.bournei’s leaf agar，PBLA)培养基、孟加拉红(Rose Bengal Agar)培养基、查彼培养基(Czapek Dox Agar) 、SNA培养基(Synthetic low nutrient Agar) 、燕麦琼脂培养基(Oatmeal agar medium，OA)。将直径为5 mm的菌饼接种至不同培养基，25℃暗培养5 d，然后采用“十字交叉法”测定菌落生长直径，5次重复。

2) 温度。试验温度设15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共5个梯度，取直径为5 mm的菌饼接至PDA平板中央，分别在不同温度条件下暗培养5 d，然后采用“十字交叉法”测定菌落生长直径，5次重复。

3) pH。用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液分别调节PDA培养基pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共5个梯度，取直径5 mm 菌饼分别接种于不同pH的PDA培养基平板，25℃条件下暗培养5 d，然后采用“十字交叉法”测定菌落生长直径，5次重复。

4) 光照。取直径5 mm菌饼接种至PDA平板中央后，分别置于全黑暗、12 h光暗交替和日光灯连续照射条件下，25℃暗培养5 d，然后采用“十字交叉法”测定菌落生长直径，5次重复。

5) 碳、氮源。以查彼培养基为基础培养基，将等量的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、果糖为碳源，以不添加碳源为对照；将等量的蛋白胨、尿素、硝酸铵、酵母浸粉、牛肉膏为氮源，以不添加氮源作为空白对照；取直径5 mm 菌饼分别接种于不同条件的培养基，25℃条件下暗培养5 d，然后采用“十字交叉法”测定菌落生长直径，5次重复。

6) 菌丝的致死温度。设40℃、45℃、50℃、55℃和60℃共5个梯度，在无菌环境下，将无菌水加入5 mL的离心管中，取直径5 mm菌饼放入离心管中并置于不同温度的水浴锅中水浴10 min，再接回PDA平板中，25℃条件下暗培养5 d，然后采用“十字交叉法”测定菌落生长直径。5次重复。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0对数据进行统计分析，用最小显著差数(LSD)法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 病原菌及其致病性

从闽楠患病叶片品中共分离得215个真菌菌株，经形态学初步检测合并菌株后确定为15种。分离后确定的菌株按回接试验结果显示，菌株CB-2和CB-3均可产生叶斑病症状(图1B)。其中，菌株CB-2和CB-3在30片病叶样品中均有出现，其分离率分别为78.0%和86.0%。观察闽楠叶斑病症状发现，病害初期在侵染点周边呈黑点状，后期逐渐扩大形成黑褐色不规则病斑，病斑边上常产生密集的黑色小点，潮湿环境下发病部位常密布病原菌丝，与野外自然发病症状一致(图1A)。对离体回接叶片进行病原菌的再分离，经形态学对比，同样与菌株CB-2和CB-3一致。经柯赫氏法验证，可确定菌株CB-2和CB-3为闽楠叶斑病致病菌。

注：A为野外发病病样，B为离体回接致病症状。

2.2 病原菌的鉴定

2.2.1 形态学 菌株CB-2在PDA平板上的菌落生长呈圆形(图2-A)，初期为白色，培养5～6 d后变为鼠灰色，菌丝蓬松，有黑色小点，背面为黄绿色，近圆形，气生菌丝浓密(图2-B)。菌落生长速率12.4 mm/d。其分生孢子为无色，单胞，呈圆柱形，两端钝圆，大小为(15.0～25.0)μm×(4.0～7.5)μm(图2C～D)。根据《植物病原真菌学》的方法初步鉴定菌株CB-2为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloesporioides)。菌株CB-3在PDA平板上菌落为白色絮状，气生菌丝浓密，背部淡黄色，具轮纹，生长较快。20 d 后菌丝表面形成黑色墨汁状黏液，排列松散不规则，即为分生孢子堆，分生孢子梗短，圆柱形，无色。成熟分生孢子纺锤形，直或略弯，具4隔膜5细胞，大小(18.4～22.5)μm×(5.0～7.5)μm，初步鉴定菌株CB-3为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)[9]。

注：A为菌株CB-2的菌落，B～D为菌株CB-2的孢子及菌丝。

2.2.2 rDNA-ITS序列分析 以菌株CB-2总DNA为模板，ITS1/ITS4为引物扩增得到长度542 bp的序列，GenBank接收号为MK728960。该菌株序列经NCBI在线BLAST比，与GenBank号为MH700457.1、MF379341.1的胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的碱基序列覆盖度达100%，序列相似度高达99%。用MEGA7.0 NJ法构建系统发育树后发现其形成明显的分枝，其中菌株CB-2与不同菌株来源的胶孢炭疽菌聚类为同一分枝(图3)，遗传距离最近，结合形态学特征确定菌株CB-2为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

注：●为菌株CB-2，◆为外源菌株。

2.3 不同因素对胶孢炭疽菌菌丝体生长的影响

2.3.1 培养基 从图4可知，PSA培养基最利于胶孢炭疽菌菌落的生长，培养5 d后的菌落直径达9 cm，且菌丝最为茂密。在燕麦培养基上菌落生长速度仅次于PSA培养基，但在燕麦培养基上菌丝生长太过稀薄。在PDA+楠木叶煎汁琼脂培养基上菌落直径位于燕麦培养基之后。在察氏、SNA、PDA+维生素B6培养基中菌落生长较慢，在PDA、虎红培养基上菌落直径显著降低，在对照组WA培养基上基本不生长。PSA培养基菌落直径显著大于其余培养基，WA培养基菌落直径显著小于其余培养基，其余基培养基间菌落直径差异显著或不显著。

图4 不同培养基闽楠叶斑病病原菌菌丝的生长状况

2.3.2 温度、pH与光照 从图5看出，不同温度、pH和光照下闽楠叶斑病病原菌菌落的生长状况。温度：病菌菌落在15～35℃均可生长，以25℃时菌丝的生长速度最快，各温度下菌丝的生长速度依次为25℃>30℃>20℃>15℃>35℃。其中，25℃时菌丝的生长速度显著大于除30℃外的其余温度处理，35℃菌丝的生长速度显著小于其余温度处理。pH：为9.0时菌落直径最大，各pH下菌落的生长速度依次为pH 9.0>pH 7.0>pH 8.0>pH 5.0>pH 6.0，pH 9.0与pH 7.0菌落直径显著大于其余pH处理，但二者间差异不显著，其余pH处理间差异不显著，表明该菌株不适宜在过酸或过碱的环境下生长。光照：全光照条件下菌落生长最好，菌落直径为9 cm；光暗交替次之，菌落直径为4.6 cm；全黑暗条件最差，菌落直径为3.9 cm；全光照显著大于光暗交替和全黑暗，光暗交替和全黑暗间差异不显著。此外，在全黑暗情况下，菌丝生长扩散性不强，生长比较密集，趋于块状生长。

图5 不同温度、pH和光照下闽楠叶斑病病原菌菌丝的生长状况

2.3.3 碳源与氮源 从图6可知，不同碳源和氮源下闽楠叶斑病病原菌菌落生长的变化。碳源：各处理菌株均可生长，但菌落直径存在差异。菌落直径以麦芽糖最大，为4.90 cm；对照最小，为1.6 cm；各处理依次为麦芽糖>葡萄糖>蔗糖>果糖>可溶性淀粉>乳糖>对照。其中，麦芽糖显著大于除葡萄糖和蔗糖外的其余处理，对照显著小于其余处理，其余处理间差异显著或不显著。氮源：各处理菌株均可生长，但菌落直径存在差异。菌落直径以酵母浸粉最大，为4.3 cm；尿素最小，为0.5 cm；各处理依次为酵母浸粉>硝酸铵>蛋白胨>牛肉膏>对照>尿素。酵母浸粉显著大于其余处理，尿素显著小于除对照外的其余处理，其余处理间差异显著或不显著。

图6 不同碳源与氮源下闽楠叶斑病病原菌菌丝的生长状况

2.3.4 胶孢炭疽菌菌丝致死温度 不同温度水浴处理结果表明，菌丝块在35～45℃水浴处理10 min后，置于PDA平板上培养，均可正常长出菌丝，50℃、55℃和60℃处理10 min，培养10 d后仍未观察到菌丝生长。可见，胶孢炭疽菌菌丝的致死温度为50℃下10 min。

3 结论与讨论

闽楠是我国特有树种，该树种的生理特性、苗木繁育、群落生态、遗传多样性和野外资源等已有研究报道[11-14]，但对闽楠病害的研究报道极少。陈全助等[9]研究结果表明，引起闽楠叶斑病的病原菌为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)。研究结果表明，除P.microspora可引起闽楠叶斑病外，胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)也可引起闽楠叶斑病的发生。C.gloeosporioides寄主范围广泛，可侵染山楂、苹果、桂花、决明子和柿树等多种树种，引起相关病害[15-19]，C.gloeosporioides侵染闽楠叶片引起叶斑病为国内首次报道。

研究结果表明，C.gloeosporioidesCB-2的生物学特性与张翊等对C.gloeosporioides的生物学特性研究结果不完全一致[20]，这可能与菌株来源不同或菌株所处环境差异有关。C.gloeosporioidesCB-2在25℃时更利于菌株的生长，当温度继续升高或下降菌株生长均呈下降趋势。推测闽楠叶斑病的发生多在25℃左右，因此，在这个温度对应的季节之前应做好该病害的防控工作。全光照更利于菌株的生长，结合闽楠自身生长特性为阴性树种，因此，要尽量避免闽楠幼苗栽植在光照较强的地域，或在幼苗栽植过程中做好遮阴处理，即可满足闽楠自身生长特性所需，也可减少闽楠叶斑病的发生。另外，结合C.gloeosporioidesCB-2的其他生物学特性及闽楠生长特性，在其幼苗栽植及管护过程中要注意合理的播种密度，保持苗木通风，适度喷灌，控制幼苗期光照时长，做好遮阴处理，在温度达25℃前做好病害的防控工作。