超高效液相色谱—串联质谱法测定蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸

胡丽俐 黎 瑛 汪 辉 皮露露 陈先桂 蒋 莉

(长沙市食品药品检验所国家酒类产品质量监督检验中心，湖南 长沙 410006)

蜂蜜是一种营养丰富的天然食品，其中60%～80%是人体容易吸收的葡萄糖和果糖，还含有丰富的矿物质、维生素、氨基酸、酶等生物活性成分，具有抗菌消炎、抗氧化防衰老、抗癌增强免疫等生物功能，对骨质疏松症、胃肠道问题以及肝脏、心血管疾病有治疗作用[1]。随着消费者对蜂蜜需求量的增加，蜂蜜市场造假现象日趋严重，假蜂蜜不仅对人体的滋补效果较小，还容易引发肥胖、糖尿病、高血压、脂肪肝、急慢性肾损伤等疾病，严重危害消费者的身体健康[2]。同时，这种不正当的竞争损害了正规商户的利益，扰乱了正常的市场秩序。蜂蜜造假手段多样，常见的造假模式是以葡萄糖、果糖糖浆等为原料，添加色素、蜂蜜香精进行勾兑[3-4]。目前已建立了多种蜂蜜的鉴别检测方法，但大多数是基于蜂蜜外源性掺假物质成分的分析[5]，而有关其内源性成分的分析方法较少。

10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)是由Butenandt从蜂王浆中分离出来，并且通过红外光谱确定了其结构[6]。10-HDA主要分泌于工蜂的上颚腺[7]。潘建国等[8-9]先后从蜂胶和蜂王胎中成功分离出10-HDA，平均含量分别为0.22%和0.15%。现有10-HDA的检测方法主要有高效液相色谱法[10-11]、气相色谱法[12]、气相色谱—质谱联用法[13]、薄层色谱法[14]、毛细管电泳法[15-16]、分光光度法[17]和红外光谱法[18]等。气相色谱法需进行甲基化衍生，操作繁琐；薄层色谱法易受试验环境等多因素影响，方法重现性差。以上方法仅适用于蜂王浆及其制剂中高含量10-HDA的测定，对于含量较低的蜂蜜难以达到检测要求。试验拟建立10-HDA的超高效液相色谱—串联质谱方法，并结合固相萃取技术实现蜂蜜中10-HDA的测定，以期为蜂蜜的真假鉴别提供一种内源性成分分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)标准品：纯度>97.5%，中国食品药品鉴定研究院；

乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

试验用水：超纯水，美国Millipore超纯水仪制备；

固相萃取柱：ProElut PLS 200 mg/6 mL，北京迪马科技有限公司；

蜂蜜：市售。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪：1290 Infinity Ⅱ型，美国安捷伦科技有限公司；

三重四级杆串联质谱仪：6470型，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司；

超声波清洗仪：KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

固相萃取装置：HSE-24B型，天津市恒奥科技发展有限公司；

氮吹仪：N-ECAP45型，美国Organomation 公司；

涡旋混合器：SK-1型，江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

(1) 标准储备液：准确称取10-HDA标准品10.56 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃避光保存。

(2) 标准中间液：准确吸取标准储备液1.00 mL，用甲醇稀释并定容至100 mL，配制成1.00 μg/mL的标准中间液，于-20 ℃避光保存。

(3) 溶剂标准工作液配制：准确吸取一定体积的1.00 μg/mL的标准中间液至10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成质量浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 μg/mL的标准工作液，现用现配。

(4) 基质匹配标准工作液配制：将1.3.2净化处理后的基质溶液氮气吹干，分别准确吸取1.00 mL相应浓度的标准溶液复溶，配制成质量浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 μg/mL的基质匹配标准工作液，经0.22 μm有机滤膜过滤，现用现配。

1.3.2 样品前处理

(1)提取：准确称取1.00 g试样置于10 mL螺旋盖聚丙烯离心管中，加入8 mL甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=4∶6)，涡旋溶解，超声提取10 min，用甲醇—水溶液定容至10 mL，待净化。

(2) 净化：准确吸取5 mL提取液，加入到预先用5 mL甲醇和5 mL水平衡的ProElut PLS 200 mg/6 mL固相萃取柱中，用5 mL水进行淋洗，弃去所有流出液，抽干固相萃取柱，再用5 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液，于40 ℃水浴下氮气吹至近干，加入甲醇溶解并定容至1 mL，涡旋混匀1 min，经0.22 μm有机滤膜过滤，供超高效液相色谱—串联质谱测定。

1.3.3 前处理条件优化 按1.3.2的方法对样品前处理过程中的提取溶剂(V甲醇∶V水=2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2)进行优化。

1.3.4 液相色谱条件优化 采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)对目标物进行分离，优化有机相和水相溶液，通过比较峰形和响应，选择合适的流动相(乙腈—水、甲醇—水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵、甲醇-5 mmol/L乙酸铵)。优化梯度洗脱程序，确定液相色谱条件。

1.3.5 质谱条件优化 分别在电喷雾正离子(ESI+)和电喷雾负离子(ESI-)模式下进行Scan扫描，得到对应的质谱总离子流图，确定化合物的母离子。对选定的母离子进行Product ion扫描，得到二级质谱图，选取丰度最强的碎片离子作为定量离子，次强的碎片离子作为定性离子，分别对子离子的碰撞能进行优化。在多反应监测模式(MRM)下，优化干燥气温度、干燥气流量、雾化气压力、鞘气温度、鞘气流量、毛细管电压、喷嘴电压等参数。

1.3.6 方法学验证

(1) 基质效应：分别用甲醇和1.3.2净化处理后的基质溶液制备相同浓度的低、中、高3个水平的标准工作溶液，评价基质效应。

(2) 线性范围、检出限和定量限：配制质量浓度分别为 0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 μg/mL的基质匹配标准工作液，绘制基质匹配标准曲线。取代表样品，逐步定量地添加标准溶液，按1.3.2的方法进行处理，信噪比>3时的添加量为检出限，信噪比>10时的添加量为定量限。

(3) 准确度和精密度：取代表样品进行低、中、高3个浓度水平添加，每个添加水平平行测定6次，计算回收率。同时对等分样品进行6次平行测定，评估目标物的日内精密度。连续3 d内，对等分样品进行6次平行测定，评估目标物的日间精密度。

(4) 干扰试验：在代表样品提取液中加入喹诺酮类、四环素类、氯霉素类药物，配成最终质量浓度均为0.10 μg/mL的溶液，用试验方法进行分析，考察其他物质对目标物是否存在干扰。

1.3.7 数据处理 测量数据由Data Acquisition 进行采集，定量软件Quantitative Analysis 10.0 分析，使用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的确定

试验发现，当样品提取液经过固相萃取小柱时，强极性物质如果糖和葡萄糖等直接流出，目标物10-HDA被吸附在小柱上，先用水淋洗将样品中残留的强极性杂质去除，再用甲醇将10-HDA 洗脱下来。当提取溶剂中甲醇体积分数≤40%时，提取液经ProElut PLS固相萃取小柱的流出液和水淋洗液中均未检测到10-HDA；当V甲醇∶V水=5∶5时，流出液中检出10-HDA。故采用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=4∶6)作为提取溶液。

2.2 液相色谱条件的确定

结果表明，采用乙腈—水为流动相体系时，10-HDA的响应值最高，但峰形不佳；采用甲醇—水为流动相体系时，10-HDA的响应一般，且峰形较差；采用乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水为流动相体系时，10-HDA离子化受到抑制，响应明显降低；采用乙腈-5 mmol/L乙酸铵、甲醇-5 mmol/L乙酸铵为流动相体系时，均能得到良好的峰形、最佳的分离效果和稳定的响应值(见图1)。由于甲醇毒性较小且成本较低，因此选择5 mmol/L乙酸铵(A)—甲醇(B)作为流动相，优化梯度洗脱程序见表1，色谱柱温度为35 ℃，进样量为5 μL。

1. 10-HDA a. 乙腈-0.1%甲酸 b. 乙腈-5 mmol/L乙酸铵 c. 甲醇-5 mmol/L乙酸铵 d. 乙腈-水 e. 甲醇-0.1%甲酸 f. 甲醇—水

表1 梯度洗脱程序

2.3 质谱条件的确定

10-HDA的分子式为C10H18O3，相对分子质量为186.2。试验过程中， ESI+、ESI-模式下准分子离子峰[M+H]+和[M-H]-的m/z分别为187.2，184.9，ESI-模式下的响应值高于ESI+的，故采用ESI-模式。在ESI-模式下，选择m/z为184.9的离子作为母离子，进行Product ion扫描，得到10-HDA的二级质谱图。10-HDA在碰撞室中主要碎裂成m/z为138.8，110.8的碎片，推测其可能的裂解途径为图2。选择184.9/138.8、184.9/110.8离子对作为多反应监测(MRM)的离子对，其中184.9/138.8的响应值更高，故将其作为定量离子对，184.9/110.8作为定性离子对。在多反应监测(MRM)下优化各项参数，得干燥气温度为325 ℃、干燥气流量为8 L/min、雾化气压力为0.31 MPa、鞘气温度为400 ℃、鞘气流量为11 L/min、毛细管电压为-3 500 V、喷嘴电压为500 V，目标物的相关质谱参数见表2。

图2 10-HDA可能的裂解途径

表2 10-HDA的质谱参数

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应评价 样品基质中的干扰物质对目标物电离效率的影响用基质效应(ME)来评价。当|ME|≤20%时，基质效应对结果的准确性影响不大，可以忽略不计；当|ME|>20%时，基质效应较强，对定量结果会产生较大干扰。由表3可知，蜂蜜中10-HDA在低、中、高3个浓度水平的ME为-29.9%～-45.5%，存在明显基质抑制效应。因此，采用基质匹配标准曲线来定量，以获得更加准确的结果。

表3 蜂蜜中10-HDA的基质效应

2.4.2 线性范围、检出限和定量限 10-HDA的基质匹配标准溶液在0.05～0.80 μg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=12.4X-283.7，相关系数为0.995。方法的检出限为 0.03 mg/kg，定量限为 0.10 mg/kg。

2.4.3 准确度和精密度 在0.10，0.20，1.00 mg/kg添加浓度水平下，10-HDA的平均回收率为96.9%～108.3%，相对标准偏差为4.5%～10.7%。由表4可知，日内精密度和日间精密度分别为5.9%～9.2%和3.5%～14.3%。

表4 方法的回收率与精密度

2.4.4 干扰试验 文献[19-20]报道，蜂蜜中可能有喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、硝基呋喃类药物残留。采用试验方法分析含有以上药物的溶液，在目标物保留时间区域未发现干扰，将以上药物加入到代表性样品中，目标物浓度未发生改变[21]。因此，试验方法有良好的抗干扰能力。

2.5 实际样品分析

应用试验方法对12个蜂蜜样品进行检测，由图3可知，除1个假蜂蜜样品未检出10-HDA外，其余11个蜂蜜样品中均有检出10-HDA，最高含量为0.96 mg/kg，最低含量为0.22 mg/kg，说明10-HDA作为内源性成分在蜂蜜中普遍存在的。

图3 基质标准溶液和典型样品溶液MRM色谱图

3 结论

建立了蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸的超高效液相色谱—串联质谱检测方法。该方法操作简便，无需进行气相色谱法繁琐的衍生化处理；灵敏度高，检出限和线性范围等参数均优于高效液相色谱法；且重现性好，抗干扰能力强于薄层色谱法。试验方法能够满足蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸的定性定量分析。由于蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸的含量受蜜源种类、地理环境等因素影响，后续将加大对不同种类和产地的蜂蜜监测，完善蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸含量的数据。