小麦醇溶蛋白沸石分离工艺优化及其组分分析

王丹丽 刘 璐 张逸凡 连喜军

(1. 天津商业大学理学院，天津 300134；2. 天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；3. 天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)

小麦醇溶蛋白为单体蛋白，分为α、β、γ、ω4种不同类型，是面筋蛋白的重要组分[1-2]。麦醇溶蛋白缺乏弹性，使面筋黏稠并具有延展性和流通性，因其能促进小麦淀粉回生，因此可作为食品添加剂用于制备高品质的回生淀粉[3-7]。利用体积分数为65%的乙醇水溶液浸泡谷朊粉提取醇溶蛋白是制备醇溶蛋白的常用方法[8-9]，但关于从提取液中分离出醇溶蛋白固体及将不同性质醇溶蛋白组分分离的研究较少。利用高效液相色谱层析方法可鉴定和分离醇溶蛋白，该方法准确度高、重现性好，但试验成本高，而且分离时间长、产物少[10-11]。

柱层析法是利用混合物中各组分在固定相和流动相中溶解度的差异，经多次分配将各组分分离而达到纯化的目的[12]。柱层析试验设备简单，且分离产物纯度比较高[13]。该法被广泛应用于制药、食品、化工等领域[14-16]。沸石是天然存在且分布广泛的离子交换材料，具有选择性吸附和筛分能力，可用于柱层析的固定相中[17-18]。与高效液相色谱层析方法相比，采用改性沸石柱层析制备不同分子量醇溶蛋白组分，不需要昂贵设备，过程简单，可高效分离出不同分子量的醇溶蛋白组分。

试验拟研究碱液处理沸石分离不同性质醇溶蛋白组分工艺，以期为乙醇浸提谷朊粉制备醇溶蛋白提供可借鉴的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷朊粉：思象粉业有限公司；

无水乙醇、氢氧化钾：分析纯，天津市诺奥科技发展有限公司；

碱性蛋白酶：2 000 U/g，天津市诺奥科技发展有限公司；

天然沸石(黑火山土)：市售；

电热恒温鼓风干燥箱：DH-101-3BS型，天津市中环实验电炉有限公司；

低速离心机：L535-1型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

紫外可见分光光度计：Lambda25型，美国PerkinElmer公司；

台式电热恒温培育箱：WP25A型，天津市泰斯特仪器有限公司；

扫描式电子显微镜：KH-8700型，浩视中国有限公司；

旋转蒸发器：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

增力电动搅拌器：JJ-1型，天津市华仪鑫达仪器仪表有限公司；

电子天平：YD202N型，上海精密科学仪器有限公司；

液相色谱仪：安捷伦1260 Infinity Ⅱ型，安捷伦科技公司；

多角度激光光散射仪：DAWN HELEOS Ⅱ型，美国怀雅特公司；

动态激光光散射仪：DynaPro NanoStar型，美国怀雅特公司。

1.2 试验方法

1.2.1 醇溶蛋白粗提物制备 将市售谷朊粉200 g按液料比(V乙醇∶m谷朊粉)30∶1 (mL/g)溶于体积分数为65%的乙醇，置于30 ℃水浴中并搅拌2 h，3次离心(3 500 r/min，3 min)，取上清液，用旋转蒸发器蒸出乙醇后，所得浓缩液为醇溶蛋白组分1；将提取的上清液冷藏，分别于4，10，20，30 ℃下静置凝沉1，2，4，8，10，20，40 h，所得沉淀为醇溶蛋白组分2，该醇溶蛋白干重与谷朊粉干重(每200 g谷朊粉的干重为48 g)的比值为凝沉率；用旋转蒸发器将冷藏后的上清液浓缩冻融后离心，所得上清液为醇溶蛋白组分3，沉淀为醇溶蛋白组分4。测量沉淀的质量并通过光学显微镜观察样品形貌。

1.2.2 沸石碱处理 向玻璃瓶中加入500 g沸石，然后加入KOH溶液(质量分数分别为20%，50%，80%)直至没过沸石1～2 cm。将装有沸石的玻璃瓶放入水浴锅中，分别设定4个不同加热温度(30，50，70，90 ℃)和3个不同加热时间(30，60，120 min)；将KOH溶液处理过后的沸石加蒸馏水洗至中性，自然风干。

1.2.3 沸石吸附醇溶蛋白 将4 ℃下静置凝沉12 h制备的醇溶蛋白溶解于体积分数为65%的乙醇中，向其中加入经KOH处理并干燥的沸石，沸石量没过溶液即可，吸附3 h后将溶液倒出。

1.2.4 醇溶蛋白组分分离 采用层析法。将乙醇作为柱层析中的流动相，以经碱处理的沸石为固定相，向层析柱中加入已经KOH处理并吸附过醇溶蛋白的沸石，量取适量的无水乙醇倒入层析柱中，乙醇溶液没过沸石1～2 cm(约为300 mL)，待沸石吸附10 min后，打开开关将层析出的醇溶蛋白溶液放出，每个样品层析出的液体按照顺序平均分为三等份接出，每个组分为100 mL，分别标记为A、B、C。

1.2.5 醇溶蛋白紫外最大吸收波长的确定 将每个样品的3个组分在4 ℃下冷藏12 h后，取出样品，将上清液收集在一起后用旋转蒸发仪回收乙醇，剩余液体冷藏所得沉淀即为醇溶蛋白，将样品去皮后称其重量，分析碱质量分数、碱处理时间、碱处理温度对沸石分离醇溶蛋白组分的重量的影响。取出若干试管，向其内加入4～5 mL的体积分数为65%的乙醇，用钩针钩取每个样品的每个组分的沉淀，放入乙醇液中充分溶解后采用紫外分光光度计测定其紫外最大吸收波长。

1.2.6 醇溶蛋白分子量测定 按照文献[19]的测定方法，以沸石柱层析分离所得三组分作为流动相，利用高效凝胶渗透色谱联用多角度激光散射和示差折光仪(HPSEC-MALLS-RID)进行分析，采用Astra6 软件收集和处理数据。

1.3 统计学处理

每个数据均取自3个重复试验的均值，采用F检验，利用SPSS软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 醇溶蛋白凝沉率与静置凝沉温度及时间关系

将谷朊粉醇提溶液分别在4，10，20，30 ℃下静置凝沉1，2，4，8，10，20，40 h，测定凝沉出的醇溶蛋白凝沉率，结果如图1所示。

图1 醇溶蛋白凝沉率与静置凝沉温度及时间的关系

由图1可知，静置凝沉前1 h，4，10 ℃两组样品醇溶蛋白凝沉速率迅速增长且远多于另外两组，另外两组几乎未凝沉出醇溶蛋白；1～4 h时，20，30 ℃两组样品凝沉速率开始缓慢增长，而4，10 ℃两组醇溶蛋白增长趋缓；4～20 h时，20，30 ℃两组样品凝沉速率小幅增长，20 h时两温度下沉淀量接近，4 ℃下的凝沉率比其他各组都快，沉淀量超过了10 ℃的样品，成为沉淀量最多的组分，而10 ℃下的样品凝沉较为缓慢。凝沉20～40 h时，20，30 ℃两组样品凝沉速度加快。静置40 h后，4，10，20，30 ℃下醇溶蛋白的凝沉率分别为16.6%，20.6%，24.0%，18.9%，经40 h静置凝沉之后，30 ℃和10 ℃下最终提取的醇溶蛋白质量相近，而20 ℃下的样品提取量最大，4 ℃下能更快地凝沉出接近最大沉淀量的醇溶蛋白。

2.2 不同温度和时间沉淀出醇溶蛋白光学显微图像特征差异比较

图2为不同温度和时间醇溶蛋白提取液及冻融沉淀的光学图像特征差异比较。将第1组分和第3组分进行对比，可以看出第1组分的醇溶蛋白聚集程度相对较低，可见通过冻融之后，醇溶蛋白的聚集程度获得了提升，说明样品经冻融处理更加容易提取。将第2组分和第4组分进行对比，可以看出醇溶蛋白形状上有明显变化，第2组分的醇溶蛋白以小体型聚集为主，而且形状扁平，第4组分的醇溶蛋白则是体型偏大的聚集为主。说明经过冷冻之后，样品中醇溶蛋白的聚集性比仅经过冷藏的样品强，更容易凝聚沉淀。因此，要想得到更多的醇溶蛋白提取物，宜将谷朊粉醇提液浓缩后先进行冷藏，再进行冻融处理。

图2 不同温度和时间醇溶蛋白提取液及沉淀的光学显微图像特征差异比较

图3为不同温度和时间下，静置凝沉醇溶蛋白的光学图像特征差异比较。由图3可以看出，在第1 h冷藏凝沉醇溶蛋白的图像中，4个温度下的醇溶蛋白分布都比较散乱，大小各不相同且无规律。第2 h的与第1 h时相似，但球状醇溶蛋白(α-、β-、γ-醇溶蛋白[20-21])逐渐汇聚。第4 h的图像中，在4，10 ℃下静置凝沉的醇溶蛋白都接近圆形，且聚集程度更高，而另外两组的醇溶蛋白形状无规律，且分布较分散。第10 h的图像中，4 ℃的出现了虫状醇溶蛋白(ω-醇溶蛋白[22])，10 ℃的醇溶蛋白出现了程度较轻的变扁，20 ℃的醇溶蛋白呈椭圆状，这3个温度下凝沉的醇溶蛋白分布均较为集中，且4 ℃的醇溶蛋白最为集中；40 ℃样品显微图像中醇溶蛋白形状依旧无规律且分布较为散乱。在20 h时，4，10，20 ℃的样品均以虫形ω-醇溶蛋白为主，夹杂部分椭圆形醇溶蛋白，密集程度都较高，30 ℃的样品依旧是以圆形的α-、β-、γ-醇溶蛋白为主，且密集程度则稍微稀疏一些。在40 h的样品图像中，不同温度下的醇溶蛋白皆以圆形为主，仅含有少量虫状ω-醇溶蛋白，可能在此阶段球状α-、β-、γ-醇溶蛋白聚集到虫状ω-醇溶蛋白表面，相互融合形成了大的球状结构。综上所述，为了高效制备醇溶蛋白，4 ℃静置冷藏效果最佳。

图3 不同温度和时间沉淀出醇溶蛋白光学显微图像特征差异比较

2.3 预处理条件对沸石分离醇溶蛋白组分的影响

图4和图5为经不同工艺预处理沸石对分离醇溶蛋白提取量及其组分紫外吸收光谱的影响。由图4可知，在不同处理温度和不同处理时间情况下均表现出KOH溶液质量分数越低，分离出醇溶蛋白的量越多的规律。即，所分离的醇溶蛋白的量与KOH溶液质量分数呈反比。结合图5(a)可知，在温度为30 ℃、处理时间为30 min的条件下，KOH溶液质量分数为20%，50%，80%时，组分A的最大吸收波长分别为288.4，288.6，288.6 nm，吸光度分别为0.471，0.291，0.219，KOH质量分数为20%时的吸光度最大且峰形窄。因此，质量分数为20%时分离出醇溶蛋白最纯。

同样，由图4可见，沸石处理时间越长，所分离出来的醇溶蛋白量也越多，结合图5(b)可以得到，沸石处理时间为30，60，120 min的最大吸收波长分别为288.4，288.0，289.6 nm，吸光度分别为0.351，0.368，0.605，时间为120 min时吸光度最大且峰形窄。因此，处理沸石时间为120 min时分离出的醇溶蛋白最纯。

图4 不同工艺预处理沸石对分离醇溶

由图4还可以看出，在沸石改性中，随温度上升，沉淀重量先上升后减少，然后再上升，即大多条件下，温度在50 ℃时所分离出的蛋白量最多，结合图5(c)可得出，在50，70，90 ℃下，组分A的最大吸收波长为288.0，288.4，289.6 nm，吸光度分别为0.364，0.308，0.164，温度为50 ℃时的吸光度最大且峰形窄。因此，处理沸石温度为50 ℃时分离出醇溶蛋白最纯。

由单因素结果可知，沸石处理温度为50 ℃、KOH溶液质量分数为20%、处理时间为120 min时醇溶蛋白分离量最大。按照最佳工艺参数醇溶蛋白最大分离量为10.336 g/kg沸石，同组未经碱液处理沸石所分离出的醇溶蛋白为4.730 g/kg沸石，分离最大量相较于空白试验分离量多出5.606 g/kg沸石。进而观察同一组样品分离出的3个组分的蛋白是否一样。由图5(d)可知，分离出的醇溶蛋白不同组分的最大吸收波长基本相同，通过紫外最大吸收波长无法判断醇溶蛋白中α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白各组分的比例。

图5 不同方式预处理沸石后所分离醇溶蛋白组分的紫外吸收光谱图

2.4 沸石分离醇溶蛋白组分中醇溶蛋白各组分比例

表1为沸石柱层析分离所得三组分中醇溶蛋白组分分子量及含量。由表1可知，柱层析A组分主要成分是低分子量醇溶谷蛋白，B组分主要成分是高低分子醇溶谷蛋白和α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白，C组分主要成分为低分子量醇溶谷蛋白。但C组分中的高分子量醇溶谷蛋白分子量比A、B组分中的大很多，进而使该组分的平均分子量远远大于A、B组分。大分子量醇溶谷蛋白对于面筋延展性具有重要作用，因而制备该类蛋白添加剂用于面条等食品中可大大减小面条煮熟过程的断条率。

表1 沸石柱层析分离所得三组分中醇溶蛋白组分分子量及含量†

3 结论

通过对不同条件下的醇溶蛋白的提取情况以及其提取物的显微图像进行分析，探究醇溶蛋白的最佳提取条件，并以最佳条件下制备的醇溶蛋白为原料，通过对分离情况及紫外波长、蛋白组分分子量等分析研究碱液处理沸石分离醇溶蛋白组分工艺。结果表明，温度对醇溶蛋白凝沉速率影响很大，贮存在4 ℃环境下谷朊粉中提取醇溶蛋白的效果最好，提取率可达24%；KOH改性沸石后所分离醇溶蛋白量与KOH溶液质量分数呈反比，与改性时间呈正比，温度为50 ℃、KOH溶液质量分数为20%、处理时间为120 min时预处理沸石醇溶蛋白分离量最大，分离量为10.336 g/kg沸石，相较于空白试验分离量多出5.606 g/kg沸石。根据紫外波长分析，醇溶蛋白及其组分的最大紫外吸收波长在288.4 nm附近。静置凝沉过程中醇溶蛋白中α-、β-、γ-醇溶蛋白组分先沉淀析出，ω-醇溶蛋白组分最后凝沉析出。高分子量醇溶谷蛋白对于面筋延展性具有重要作用，因此对于分子量范围分布更窄的高分子量醇溶谷蛋白组分分离及应用是未来的研究和发展方向。