基于网络药理学探讨秦七风湿方治疗类风湿性关节炎的作用机制

姚卓汝 刘红波 唐志书 宋忠兴 阮凯华 徐思宁 于金高 刘世军

摘要 目的：基于網络药理学探讨秦七风湿方（QQFSF）治疗类风湿性关节炎（RA）的物质基础及其作用机制。方法：通过中医百科全书数据库（ETCM）检索QQFSF中珠子参、秦艽、山茱萸3味中药的成分和靶点;从NCBI、Geencards数据库中检索RA的相关靶点，将QQFSF治疗RA的靶点通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析及DAVID进行功能通路富集分析，预测其作用机制。运用Cyoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点-通路”网络，经拓扑学分析得到核心成分和靶点。结果：从QQFSF筛选出成分122个，其中有靶点的成分84个，共筛选到靶点420个。检索得到RA的靶点1 225个。经映射分析，获得成分与疾病的共同靶点72个。通过对网络进行拓扑分析，得到熊果酸、齐墩果酸等核心成分及ABCB1、ABCC1、PIK3CG等核心靶点。经DAVID（P<0.05）富集分析，得到62条信号通路。最后通过分子对接技术对核心成分及靶点进行验证。结论：QQFSF治疗RA的主要成分是熊果酸、齐墩果酸、棕榈酸，靶点主要涉及ABCG2、ABCB1、PIK3CG等，并通过甲状腺激素信号通路、胰岛素抵抗、核因子κB信号通路等达到治疗RA的作用。

关键词 秦七风湿方;类风湿性关节炎;网络药理学;分子对接;作用机制

Mechanism of Qinqi Fengshi Formula for the Treatment of Rheumatoid Arthritis by Network Pharmacology

YAO Zhuoru1，2，LIU Hongbo1，2，TANG Zhishu1，2，SONG Zhongxing1，2，RUAN Kaihua1，2，XU Sining1，2，YU Jingao1，2，LIU Shijun1，2

（1 Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Xianyang 712083，China; 2 State Key Laboratory of Research and Development of Characteristic Resources of Qin Medicine（Cultivation）/Shaanxi Provincial Innovative Medicine Research Center，Xianyang 712083，China）

Abstract Objective：To explore the material basis and mechanism of Qinqi Fengshi Formula（QQFSF） in the treatment of rheumatoid arthritis（RA） based on network pharmacology.Methods：ETCM databases was used to search the components and targets of 3 Chinese medicinals，namely，Panacis Majoris rhizome，Gentianae Macrophyllae Radix，and Corni Fructus in QQFSF.The related targets of RA were retrieved from NCBI and Geencards databases.The target of QQFSF in the treatment of RA was analyzed by PPI network analysis and DAVID for functional pathway enrichment analysis to predict its mechanism of action.The “Chinese medicine-component-target-pathway” network was constructed by Cytoscape 3.7.2 software.Through the topology analysis，the core components and targets were obtained.Results：A total of 122 components in QQFSF were screened，among which 84 components with targets were selected，and 420 targets were screened.A total of 1 225 targets of RA were retrieved.Through mapping analysis，72 common targets of components and diseases were obtained.A total of 1 225 RA targets were retrieved.After mapping analysis，72 common targets of ingredients and diseases were obtained.Through topological analysis of the network，core components such as ursolic acid and oleanolic acid and core components and ABCB1，ABCC1 and PIK3CG and other targets were obtained（P<0.05）.After DAVID（P<0.05） enrichment analysis，62 signal pathways were obtained.Finally，the core components and targets were verified by molecular docking technology.Conclusion：The main therapeutic components of QQFSF for RA are ursolic acid，olenolic acid and palmitic acid.The targets mainly involve ABCG2，ABCB1，PIK3CG，etc.，and its therapeutic effect is achieved through thyroid hormone signaling pathway，insulin resistance and NF-κB signaling pathway etc.for the treatment of RA.

Keywords Qinqi Fengshi Formula; Rheumatoid arthritis; Network pharmacology; Molecular docking; Action mechanism

中图分类号：R285.5;R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.005

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病[1]。目前临床治疗RA以化学药物为主，常用药物有非甾体抗炎药（NSAIDs）、水杨酸类药物、糖皮质激素及免疫制剂等[2-4]。化学药物治疗RA的短期疗效较为显著，但其作用靶点单一，对疾病的整体调控有限;同时长期使用往往会产生胃肠道、肝脏、肾等组织的诸多不良反应[5-6]。近年来，中药治疗RA的研究较多[7-9]。相比于化学药物，中药多成分、多靶点、多通路的整体治疗特点使其在RA治疗方法具有独特的优势。

组方来源于陕西太白“七”药的秦七风湿方（QQFSF）由珠子参、秦艽、山茱萸3味中药组成，是治疗RA的临床经验方，具有散寒除湿、益气养阴、祛风止痛等功效。方中珠子参益气养阴、通痹止痛，为君药;秦艽舒筋活络，为臣药;山茱萸协同君臣之味，逐湿痹痛、补益肝肾，为佐使药。本课题组前期已对QQFSF的物质成分、药理药效等进行了相关研究，结果表明QQFSF具有显著的抗炎、镇痛等功效[10-13]。目前QQFSF治疗RA的物质基础及其作用机制尚不甚明确，影响了其临床应用及相关新药的研发。

基于系统生物学理论的网络药理学，其系统性、多方位的分析特点与中医药的整体观相吻合，为揭示中药复杂的作用机制提供了一种强有力的工具[14]。我们采用网络药理学方法，从分子水平预测分析QQFSF治疗RA的作用機制，以期为QQFSF的临床应用及其新药研发提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 QQFSF成分及靶点收集 通过中医百科全书数据库（ETCM）[15]（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/）收集QQFSF中珠子参、秦艽、山茱萸3味中药所含有的成分及其靶点，ETCM中靶点的可靠性分值≥0.8，将靶点统一在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）进行规范。

1.2 RA靶点收集 以“Rheumatoid arthritis”为检索词在人类疾病相关数据库Geencards[16]（https：//www.genecards.org/）、NCBI[17]（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中收集与RA相关的靶点。

1.3 QQFSF治疗RA的成分及靶点 将收集的QQFSF成分靶点与RA靶点进行映射，得到共同靶点以及共同靶点对应的成分，即为QQFSF治疗RA的成分及靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与分析 通过STRING version 11.0（https：//string-db.org/）数据库[18]对QQFSF治疗RA的靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络模型，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值设定为“medium confidence”≥0.400，其余参数为默认值，将结果以“TSV”格式导出。通过Cytoscape 3.7.2[19]中的MCODE插件对PPI网络进行聚类分析，进一步筛选核心网络并对其参与的生物过程进行注释。

1.5 功能富集分析 将QQFSF治疗RA的靶点导入Cytoscape插件ClueGO及DAVID 6.8[20]（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）数据库，设定阈值<0.05，进行基因本体（Gene Ontology，GO）生物学过程富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，通过2个数据比较富集结果的可靠性。

1.6 QQFSF治疗RA的“中药-成分-靶点-通路”网络构建 通过Cytoscape 3.7.2软件构建QQFSF治疗RA的“中药-成分-靶点-通路”网络，利用Cytoscape内置的Network Analyzer工具对网络进行拓扑学分析，并通过连接度（Degree）等参数判断QQFSF治疗RA的核心成分及核心靶点。

1.7 分子对接验证 为了验证预测的可靠性，通过Pubchem数据库下载核心成分的结构，并通过PyMOL软件保存为“.pdb”格式，通过PDB数据库下载排名前5的核心靶点结构，通过PyMOL软件去掉水及其自身配体。将成分及靶点结构通过AutoDock软件进行加氢，计算电荷处理后保存为“.pdbqt”格式，设置Grid Box坐标及盒子大小，使用AutoDock软件进行分子对接，结合能<0且能量最低的结构为最优结构，保存结果。通过Open Babel GUI软件将对接结果的“.pdbqt”格式转化为“.pdb”格式，最后使用PyMOL软件对图像进行处理分析。

2 结果

2.1 QQFSF成分收集 通过ETCM数据库，共收集到122个成分，其中归属于珠子参含有的成分53个，秦艽含有的成分14个，山茱萸含有的成分56个。见表1。

2.2 QQFSF靶点收集 通过ETCM数据库查询到含有可靠性分值≥0.8靶点的成分共84个，其中归属于珠子参含有的成分52个，秦艽含有的成分6个，山茱萸含有的成分26个，共收集到420个靶点。

2.3 RA靶点收集 通过NCBI、Geencards（Score>20.00）数据库收集到RA的靶点分别为1 192、242个，删除重复值，共得到靶点1 225个。

2.4 QQFSF治疗RA的成分及靶点 通过将QQFSF的靶点与RA的靶点进行映射，得到共同靶点72个，对应的成分76个。见表2。共同靶点韦恩图见图1。

2.5 PPI网络及分析 将72个共同靶点通过STRING数据库进行分析，得到PPI网络。见图2。PPI网络中存在一些密度较高的区域，通常也被认为是具有生物学意义的集合[21]。为了进一步分析QQFSF治疗RA的作用机制，通过Cytoscape 3.7.2中的MCODE插件对PPI网络进行聚类分析，得到核心功能模块。见图3。对3个模块分别进行GO功能分析，保留最佳评分的生物功能及注释。见表3。

2.6 富集分析 通过DAVID 6.8数据库对72个共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析，共得到GO条目198个（P<0.05），其中生物过程（BP）条目124个，细胞成分（CC）条目27个，分子功能（MF）条目47个;3个功能前10个条目见图4。KEGG通路富集分析得到62条信号通路（含疾病）。GO富集主要集中在生物过程上，参与凋亡过程的负调控、炎症反应、固有免疫应答、一氧化氮生物合成过程的正调控、药物反应、外源代谢过程等;细胞靶点主要位于蛋白质复合物、胞外体、细胞外间隙、内质网膜等处，具有酶、类固醇、转录因子、ATP及染色质结合、ATP酶活性与物质跨膜运动等分子功能。富集的KEGG通路（含疾病）主要涉及甲状腺激素信号通路、胰岛素抵抗、癌症通路、核因子κB信号通路、催乳激素信号通路、前列腺癌等。为了验证DAVID富集结果的可靠性，将72个共同靶点导入Cytoscape中ClueGO插件进行分析，结果显示，2个数据库通路富集结果基本一致，且富集到类风湿性关节炎疾病的靶点均为ITGAL、TNFSF13B、TLR4、ITGB2，按P值排序，前10条通路分别见图5（a）、5（b），图左侧代表通路名称，气泡颜色由红到绿代表P值从小到大，横坐标代表该通路涉及的靶点占总靶点的比率。

2.7 构建QQFSF治疗RA的“中药-成分-靶点-通路”综合网络 结合以上分析，将QQFSF治疗RA的中药、成分、靶点、通路导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“中药-成分-靶点-通路”网络，对网络拓扑分析结果见图6。图中菱形代表中药，正八边形形代表成分，“V”形代表靶点，墨绿色“V”形代表珠子参和山茱萸共有靶点，红色“V”形代表3味中药的共有靶点。方形代表通路，各节点大小及颜色深浅代表度值大小。排名前10的成分是Dammar-20（22）Z，24-Di-Ene-3Β，6Α，12Β-Triol、Dammar-20（22）E，24-Di-Ene-3Β，6Α，12Β-Triol、Ursolic Acid（熊果酸）、Gypnoside V_qt、Oleanic acid（齐墩果酸）、Palmitic Acid（棕榈酸）、Pseudoginsenoside Rt1（假人参皂苷RT1）、Oleanic Acid-28-O-Β-D-Glucopyranoside、6-Hydroxystigmast-4-En-3-One、4，6-Cholestadien-3-One，对应的度值分别为20、20、17、17、17、16、13、13、11、11;排名前10的靶点是ABCG2、ABCB1、PIK3CG、ABCC1、AKT1、ATP1A1、VDR、PPP1CC、SLCO1C1、NFKB1，对应的度值分别为60、56、45、44、44、42、41、38、37、35。它们在QQFSF治疗RA的过程中发挥着重要的作用，可推测这些成分及靶点为核心成分及核心靶点。且该网络充分体现出QQFSF通过多成分、多靶点、多通路治疗RA。

2.8 分子对接结果 将QQFSF治疗RA连接度大于中位数（Degree>8）的成分（没有结构的除外）与前5个核心靶点进行分子对接，配体和受体结合能越低，结合的越稳定，分子对接部分模式见图7。分子对接结果显示，核心靶点ABCB1、ABCC1、ABCG2、AKT1、PIK3CG与成分有较好的结合力，对接资料见表4。

3 讨论

通过采用网络药理学对QQFSF治疗RA的作用机制进行了相关分析，结果发现：QQFSF中含有的竹节参皂苷Iva、齐墩果酸、龙胆苦苷、秦艽碱甲、莫诺苷、马钱苷、熊果酸等成分通过作用于NFKB1、ABCB1、AR等核心靶点，经介导调节甲状腺激素、核因子κB、胰岛素抵抗、mTOR、花生四烯酸代谢、TNF等相关信号通路而发挥治疗RA作用。分析结果初步揭示了QQFSF治疗RA的作用机制，同时亦印证了中药多成分、多靶点、多通路治疗疾病的特色与优势。

基于中药方剂的配伍原则，珠子参为QQFSF中的君药，在处方中发挥主要治疗作用。通过网络药理学分析发现，在QQFSF治疗RA的“中药-成分-靶点-通路”网络中，珠子参涉及最多的核心成分、靶点与通路，其核心成分多为皂苷类成分。此分析结果不仅印证了珠子参君药的作用，而且与文献中报道的珠子参皂苷类成分抗炎、抗肿瘤、增强机体免疫力等功效相吻合[22-24]。

珠子参中含有的竹节参皂苷Iva可通过升高IκB-α和p65总蛋白的表达抑制磷酸化蛋白p-p38、p-JNK、p-ERK以及p-STAT1的表达，进而抑制核因子κB、MAPK、STAT1等信号通路而发挥抗炎作用[25];人参皂苷Ro可通过抑制核因子κB通路而产生抗RA作用[26];齐墩果酸具有确切的促进淋巴细胞增殖作用，从而调节机体的免疫系统，且可抑制花生四烯酸的转化，从而抑制炎症的形成[27]。秦艽中含有的龙胆苦苷可通过抑制核因子κB通路中p65的核转位而发挥抗RA作用[28]。山茱萸中含有的环烯醚萜苷如马钱苷、莫诺苷等，可通过调节TLR4/核因子κB和JAK/STAT3信号通路抑制炎症[29-30]。

核因子κB信号通路在细胞炎症反应及免疫应答等过程中起关键性作用，机体受到外界刺激时，核因子κB/IκBa复合物中IκBa被激活磷酸化后降解，核因子κB被释放活化后进入细胞核，通过p50亚单位与靶基因的eB反应元件结合，激活靶基因的表达，从而产生免疫、炎症等细胞反应[31]。QQFSF可能通过抑制IκBa磷酸化、阻断核因子κB核定位及与DNA的结合或抑制靶基因表达来治疗RA。PTGS1、PTGS2等靶点参与花生四烯酸的代谢，花生四烯酸经环氧合酶途径代谢，首先通过环合形成不稳定的环内过氧化物PGG2和PGH2，在巨噬细胞、嗜中性粒细胞及淋巴细胞中，PGH2经谷胱甘肽-S-转移酶作用生成PGE2，PGE2在炎症组织中水平较高时，会扩张血管，使神经末梢对缓激肽和组胺的敏感性增加，从而导致炎症性疼痛[32]。非甾体抗炎药可通过抑制前列腺素合成酶从而產生消炎作用，QQFSF亦可通过此途径而降低RA的炎症反应。除此之外，通路与通路之间也存在协调关系，甲状腺激素信号通路同PI3K-AKT与HIF-1信号通路相互协调，核因子κB信号通路与Toll样受体信号通路、B细胞受体信号通路和破骨细胞分化之间相互协调。

综上所述，本研究采用网络药理学解析了QQFSF治疗RA的成分、靶点与通路，从分子水平阐述了QQFSF对RA疾病及机体的整体调控，为其临床应用及新药开发提供了科学参考;同时本研究的预测结果亦需通过后续的实验进行验证。

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（2020-05-12收稿 责任编辑：苍宁）