Toll样受体激动剂佐剂的研究进展

年悬悬，李军英综述，张家友，杨晓明审校

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉430207；

2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉430207；

3.中国生物技术股份有限责任公司，北京100029

佐剂分为免疫刺激佐剂和递送系统佐剂。免疫刺激佐剂来源于病原体，主要包括病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）［如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、单磷酰脂质A（monophosphoryllipid A，MPLA）、胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）的细菌DNA（CpG DNA）］，通过细胞因子或模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）诱导免疫反应，而递送系统主要将疫苗抗原靶向递送给抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APC）。PRR的发现与树突状细胞的发现意义一样。1989年，耶鲁大学教授Charles Janeway提出了天然免疫细胞PRR能特异性识别病原携带的非我组分PAMP，并预测PRR是先天免疫和适应性免疫之间的桥梁［1］。1996年，LEMAITRE等［2］发现Toll在果蝇对真菌感染的免疫中起着重要作用，从而确立了Toll的免疫学意义。1997，MEDZHITOV等［3］在果蝇胚胎背腹轴线发育的特殊分子中发现哺乳动物同源Toll蛋白，被命名为hToll，该蛋白能够激活与适应性免疫有关的基因。Toll受体的哺乳动物同源物相继被鉴定为Toll样受体（Toll-like receptor，TLR），hToll被重命名为TLR4［4］。TLR家族现由10个成员组成（TLR1~TLR10）。TLR激动剂佐剂主要涉及TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9激动剂。

本文就TLR激动剂诱导的信号通路以及其作为疫苗佐剂的应用作一综述。

1 TLR结构及信号通路

TLR是Ⅰ型跨膜蛋白，主要包括富含亮氨酸的胞外区、单个跨膜螺旋、含Toll／IL-1受体（Toll／IL-1 receptor，TIR）结构域的胞内区。胞外区：TLR胞外区的富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR）是TLR与TLR配体识别结合的部分［5］。在三维结构中，所有LRR呈环状结构，当多个LRR组装成蛋白时，形成螺线管结构，呈马蹄形，可形成同源或异源二聚体［6］。根据胞外区序列的同源性，脊椎动物TLR可分为6个亚家族：TLR1／2／6／10、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7／8／9、TLR11／12／13／21／22／23［7］。跨膜区：TLR的跨膜结构域包含1个典型的疏水残基。胞内区：TLR识别PAMP并通过其跨膜结构域与内质网UNC93B相互作用，将PAMP从内质网上运输至溶酶体中［8］。TLR的胞质部分与白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）受体家族高度相似，现被称为TIR结构域［9］。TLR信号通路的激活始于细胞质TIR结构域。在与适当的配体结合后，TLR招募包含TIR结构域的衔接蛋白，在TIR结构域下游的信号通路中，衔接蛋白-髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）起着关键作用。

TLR信号通路包括MyD88依赖途径及TLR3／4的MyD88非依赖途径［10］。MyD88依赖途径：MyD88蛋白在MyD88依赖途径中起着重要作用，MyD88在C-末端有TIR结构域，在N-末端有死亡结构域。在一些PAMP刺激下，MyD88通过死亡结构域的相互作用，招募IL-1受体相关激酶（interleukin-1 receptorassociated kinase，IRAK）。IRAK通过磷酸化激活后，与肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）结合，激活两种不同的信号通路，最终激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核转录因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），促进促炎细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）或IL-6。MyD88非依赖途径：TLR3／4激动剂通过衔接分子β干扰素（interferon，IFN）TIR结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β，TRIF）诱导IRF-3的激活，从而诱导Ⅰ型IFN、炎症因子／趋化因子的产生和DC的成熟［11-12］。见图1［13］。

图1 MyD88依赖和非依赖信号通路Fig.1 MyD88-dependent and-independent signal pathways

2 TLR激动剂佐剂

亚单位疫苗的免疫原性明显低于减毒活疫苗，需要佐剂增加其免疫原性［14］。而TLR通常激活先天免疫系统，介导适应性免疫，具有成为疫苗佐剂的潜力。单磷酰脂质A（monophosphoryllipid A，MPLA），通过降低细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的毒性获得，是TLR4激动剂，也是第一个获批用于疫苗佐剂的TLR激动剂［15］。2009年，由MPLA和铝盐组成的AS04佐剂，作为Cervarix疫苗的配伍佐剂获批使用［16］。2017年，TLR9激动剂CpG ODN1018作为heplisavb疫苗的配伍佐剂获批使用［17］。这两个TLR激动剂作为佐剂用于上市疫苗导致了一系列有关TLR激动剂的研究。

2.1 TLR3激动剂TLR3主要在多种细胞和组织细胞胞内表达，如神经外胚层、上皮细胞、成纤维细胞、某些肿瘤细胞、APC等［18］。TLR3可识别病毒复制的中间产物ds-RNA、合成的dsRNA分子聚肌苷-多胞苷酸（polyinosic-polycytidylic acid，Poly-IC）和相应的优化产物如Poly-IC12U、Poly-ICLC。Poly-IC通过TLR3和RIG-I-like受体（RIG-I-like receptors，RLR）信号传导，诱导强IFN应答。PolyI：C信号传导主要依赖于TLR3和黑色素瘤分化相关基因-5（melanoma differentiation-associated gene-5，MDA-5），并强烈驱动细胞介导的免疫和有效的Ⅰ型IFN反应。Poly-IC12U是Poly-IC的优化产物，其尿嘧啶和鸟苷残基不匹配，似乎仅通过TLR3发出信号，而不诱导MDA-5信号通路［19］。体外研究证明，Poly-IC12U具有通过上调MHCⅠ／Ⅱ类分子、CD40、CD83、CCR7和CD86激活DC［20］。Poly-ICLC含有聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，可增加对核酸酶的抗性，从而增强和延长稳定性［21］。在小鼠模型中，Poly-ICLC增强了CD8+T细胞的免疫应答，对免疫缺陷病毒具有治疗作用［22］。在卵巢癌疫苗的研究中，Poly-ICLC增强了疫苗诱导的适应性免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫应答［23］。

2.2 TLR4激动剂LPS作为一种早期发现的TLR4激动剂，因其本身制热特性，限制了其作为佐剂的使用［24］。LPS和MPLA均可激活TLR4，LPS可激活TRIF和MyD88信号通路发挥作用，而MPLA仅激活TRIF信号通路，触发NF-κB，导致促炎细胞因子的产生，如TNF-α和IL-6［25］。MPLA通过诱导NFκB、细胞因子产生和抗原特异性T细胞活化直接激活APC［26-27］。MPLA和皂苷形成AS01佐剂，是带状疱疹疫苗Shingrix的佐剂组分［28］。MPLA吸附在铝盐上，形成AS04佐剂，是人乳头瘤病毒疫苗Cervarix和乙型肝炎疫苗Fendrix的佐剂组分［16，29］，MPLA也可作为狂犬病疫苗和癌症疫苗的佐剂，并表现出较好的佐剂效果［30-31］。

葡萄糖吡喃糖脂类佐剂稳定乳剂（glucopyranosyl lipid A in A stable emulsion，GLA-SE）是TLR4激动剂。GLA-SE具有增强Th1细胞免疫，保护老年人群对抗流感病毒的感染［32］，还可激活髓样树突状细胞（myeloid dendritic cells，mDCs）产生高水平的Th1细胞因子。GLA-SE具有剂量节约效应，在大流行情况下尤其有益。GLA-SE作为融合蛋白ID93结核疫苗的佐剂，诱导了疫苗特异性体液和细胞反应［33］；作为疟疾疫苗佐剂，促进了循环Tfh细胞中滤泡外抗体的增加及长期抗体的产生［34］。

2.3 TLR5激动剂TLR5存在于各种细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、NK细胞、DCs、上皮细胞［35］。革兰阴性菌的鞭毛蛋白可通过TLR5和NAIP5／6激活先天免疫系统，鞭毛蛋白直接刺激上皮诱导免疫细胞的募集和抗菌分子的产生，并且靶向刺激树突细胞，激活天然免疫并促进T和B细胞反应［36-37］。鞭毛蛋白可通过MyD88依赖或非依赖途径激活TLR5。MyD88依赖途径会招募下游衔接蛋白，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和IkB激酶通路，导致转录因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和NF-κB分别诱导，从而激活各种对宿主防御非常重要的基因［35，38］。MyD88非依赖途径通过TRIF介导信号通路激活细胞。TRIF激活通过IRF3转录因子诱导产生抗病毒细胞因子IFN-β，IFN-β导致STAT1转录因子的激活，从而促进诱导型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，iNOS）基因转录和一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生［39］。TLR5在一些天然免疫和适应性的免疫细胞上的存在构成其佐剂活性的基础［40］。

鞭毛蛋白可与流感、HPV和手足口病等疫苗配伍，通过肌肉注射增强疫苗的免疫效果［41］。鞭毛蛋白可作为一种有效的黏膜佐剂，活化呼吸道上皮细胞分泌特定的抗菌分子和趋化因子，招募吞噬细胞诱导天然免疫应答［42-43］。Entolimod是一种重组蛋白，一种药理学上优化的鞭毛蛋白衍生物，主要用于抗肿瘤治疗［44］，也可用于急性辐射综合征、精神疾病等临床疾病的治疗［45-46］。

2.4 TLR7／8激动剂TLR7、TLR8、TLR9表达于核内体表面。人类TLR7和TLR8系统发育相似［47］。TLR7和TLR8可被富含嘌呤的ssRNA激活，诱导免疫应答的产生。TLR7主要在人浆细胞样DC（plasmacytoid dendritic cell，pDCs）中表达，并一定程度上在T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核／巨噬细胞中表达。TLR8在单核细胞、巨噬细胞、T细胞、mDC中表达［47-48］。小分子TLR-7／8激动剂迅速进入血液，激活免疫系统［49］。TLR7／8均通过MyD88发出信号，包括IL-1受体相关激酶-4（interleukin 1 receptor-associated kinase-4，IRAK-4）的募集，分别通过NF-kB和IRF7介导IFN的产生，促进促炎细胞因子的信号转导［50］。

一些TLR7／8激动剂佐剂正处于临床前研究阶段，见表1。Resiquimod作为一种常用的TLR7／8双特异性激动剂，是一种典型的咪唑喹啉分子。Resiquimod主要诱导Th1型细胞免疫［51］。Resiquimod作为HIV疫苗佐剂，促进了抗原特异性T细胞和抗体反应；作为NY-ESO-1疫苗佐剂，用于治疗高风险黑色素瘤，临床试验中显示出较好的耐受性、CD4+T和抗体反应［52］；在新型冠状病毒疫苗的研究中，也显示出了比较积极的佐剂效应［53］。Resiquimod在人体试验中耐受性较差，常见的全身副反应包括注射部位的反应性和流感样症状（发烧、头痛和不适），这些症状均与全身免疫激活有关，如血液中高浓度的细胞因子［54］。3M-052作为TLR7／8双特异性激动剂，可用于流感疫苗佐剂［55］。T7-EA作为新型TLR7激动剂，在小鼠试验中，显示其可诱导HBsAg特异性IgG2a和T细胞反应，并且打破了免疫耐受［56］。Imiquimod用于流感疫苗，在小鼠模型上，诱导了高滴度的IgG和IgM抗体［57］。Imiquimod通过诱导一些细胞因子的表达和产生来改变免疫反应，这些细胞因子进一步刺激T细胞，因此也可考虑作为新型冠状病毒肺炎的治疗药物［58］。

表1 TLR7／8受体激动剂的组成及佐剂作用Tab.1 Composition and adjuvant effect of TLR7／8 agonists

2.5 TLR9激动剂TLR识别单链磷酸盐修饰的CpG DNA或自然存在的磷化DNA［64］。非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸（cytidinephosphate-guanosine oligodeoxynucleotide，CpG ODN）模拟细菌DNA对TLR9的免疫刺激效应，招募MyD88、IRAK和TRAF6。这导致MAPK和转录因子的激活，如NF-κB和AP-1，导致促炎趋化因子和细胞因子的转录及分泌［65］。CpG ODN根据其结构和免疫反应机制，可分为3类：k型CpG ODN（也称为b型）、d型CpG ODN（也称为a型）和c型CpG ODN［66］。所有的CpG ODN亚类均通过激活浆细胞样DC（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）和诱导细胞因子如TNF-α和IFNα来触发免疫反应。此外，CpG ODN可增强抗体反应，但不同类型CpG ODN结构差异诱导的免疫应答具有一定差异。

3′PD Poly-G延伸与CpG ODN形成，促进了细胞的摄取并抑制了CpG ODN对核酸酶的敏感性［64］。CpG 1018作为乙肝疫苗Heplisav-B的佐剂，能更快地诱导保护性抗体滴度［67］。在一项随机双盲对照试验中，CPG 7909作为乙肝疫苗Engerix-B的佐剂，增强了细胞免疫，并具有较好的耐受性［68］。CpG 5805配伍乙肝疫苗，在小鼠模型上，增强了对疫苗的抗体反应，诱导了B细胞表面TLR9向胞内内化，从而通过缓解表面TLR9对B细胞的负面调控效以激发B细胞活力，促进CD80、CD86、CD40和MHCⅡ分子在B细胞表面表达，这可能是CpG ODN作为疫苗辅助剂增强抗体反应的机制之一［69］。SD-101是一种合成的CpG ODN，通过TLR9参与刺激pDCs，主要用于肿瘤的治疗［70］。ND-MPLA／CpG既是TLR4激动剂也是TLR9激动剂，促进了APC的激活、抗体反应和CD8+T细胞应答，在抗肿瘤方面，也具有较好的潜力［71］。研究发现，在SARS-CoV或MERS-CoV亚单位疫苗中，与单用明矾或明矾与其他TLR激动剂联合使用相比，CpG与铝佐剂联合使用可引起更高的中和抗体效价和更强的细胞免疫反应［72］。CpG与铝佐剂联合配伍的新型冠状病毒亚单位疫苗，主要诱导Th1免疫应答，并对疫苗突变株具有广谱保护效果［73-74］，免疫仓鼠后的攻毒试验发现，仓鼠肺内的病毒载量在检测限以下［75］。

3 展望

新型佐剂的使用可能引发疫苗学的一场新革命［76］。TLR4和TLR9激动剂最先被发现，作为疫苗佐剂，研究也更为深入。含有TLR4激动剂的佐剂已被批准作为几种疫苗组分。TLR4激动剂已被用作传染病疫苗佐剂、抗过敏治疗药物和癌症免疫治疗药物。TLR9激动剂被用于乙肝疫苗heplisavb中。TLR9激动剂也被研究作为疫苗成分对抗感染性疾病和抗癌免疫调节。这些佐剂在免疫功能低下的个体中表现出剂量节约和诱导强烈免疫反应的能力。TLR3激动剂作为抗癌、艾滋病和肌痛性脑脊髓炎／慢性疲劳综合征（chronic fatigue ayndrome／myalgic encephalomyelitis，ME／CFS）的免疫治疗药物有一定的疗效，但尚未被批准用于疫苗［77-79］。TLR5激动剂已用于抗肿瘤免疫治疗［80］。小分子TLR7／8激动剂已显示出作为疫苗佐剂的巨大潜力［53］。TLR佐剂可诱导长期的免疫应答。当前新型冠状病毒的变异和带来的新型冠状病毒大流行表明始终需要有效的疫苗佐剂以增强疫苗的免疫反应或促进疫苗产生广谱性保护性抗体。新型佐剂对新发传染病疫苗、既往传染病疫苗以及癌症疫苗的研制，均具有重大意义。