子痫前期患者胎盘组织中骨保护素和肿瘤坏死因子-α的表达及其与疾病发展的相关性

周向东，黄苗苗，朱凯恒，张英

安徽医科大学第一附属医院妇产科，安徽合肥230022

子痫前期（preeclampsia，PE）发生在妊娠20周后，发病机制为全身性小血管痉挛和血管内皮损伤，该病可呈持续发展，临床表现多样化，主要表现为高血压、蛋白尿、组织水肿、头痛头晕、视物模糊，进一步发展可能出现抽搐、内脏出血及多器官功能损害甚至衰竭等，因病情进展迅速，并发症多，严重危害母婴健康，是孕产妇和围产儿死亡率增加的主要原因，对于PE的早期识别与干预治疗尤为重要，目前针对此妊娠期特殊疾病的检验及检查指标十分有限，为此，开展该方面相关研究对寻找该病的发病机制具有重要意义［1］。

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）最早是在人体骨组织细胞中发现的，是人体内功能蛋白的一种，因其具有抑制骨分化、参与骨细胞代谢等功能，在骨组织修复与骨再生等领域发挥重要作用。近年来的研究表明，OPG不仅在骨组织中发挥功能作用，在其他人体组织中也起重要作用，如广泛参与机体代谢、组织细胞修复、肿瘤及免疫反应等；OPG广泛分布于心、骨骼、血管、肝脏、平滑肌等组织细胞中，有研究发现，OPG参与调控血管内皮损伤、血管钙化及微血栓形成等［2］，但在产科领域目前研究较少，特别是PE的血管病理研究方面鲜有报道。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是人体重要的炎症因子，参与机体的炎症反应、内皮和组织损伤、组织细胞凋亡等［3］。该炎症因子虽然在病理产科方面有研究报道，但在PE病理机制研究方面报道较少。而PE的重要病理生理变化之一就是血管内皮细胞损伤，进而引起临床病症，造成不良妊娠，严重者甚至危害母胎安危，因此，对PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α的表达水平进行研究，将有助于PE发病与预后的检测。本研究旨在探讨PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α的表达及其与疾病发展的相关性，为阐明PE的发病机制及探讨诊断和预后指标提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 胎盘组织 选取2019年1月—2020年12月安徽医科大学第一附属医院产科确诊为PE的单胎妊娠患者60例作为试验组［诊断标准依据《妇产科学》（第9版）］，选择胎盘母体面的无钙化区，剪取全层胎盘组织，迅速用无菌生理盐水清洗干净血块和血液，干纱布净除水分，分割成大小约1 cm×1 cm×1 cm的块状，一部分制作蜡块用于免疫组化检测，另一部分放入冻存管，于-80℃冰箱保存，用于mRNA及蛋白的提取。同时选取36例正常足月妊娠、瘢痕子宫单胎妊娠、经剖宫产分娩患者的胎盘组织作为对照组，标本留取方法同前。

1.2 主要试剂 兔抗OPG多克隆抗体和兔抗TNF-α多克隆抗体购自英国Abcam公司；鼠抗β-actin抗体单克隆抗体购自美国Proteintech公司；HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）和HRP标记的山羊抗鼠IgG（H+L）试剂盒购自北京中山金桥生物科技发展有限公司；Trizol试剂和预染蛋白分子量标准品购自美国Invitrogen公司；RNA逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂购自上海星汉生物科技有限公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂、BCA试剂盒、化学发光液和蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；预制胶购自南京金斯瑞生物公司；PVDF膜购自德国Millipore公司；通用型组化二抗（Universal Anti-Mouse／Rabbit-HRP）购自上海长岛生物公司；DAB染色液购自基因科技（上海）股份有限公司。

1.3 PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α基因mRNA表达水平的检测 采用qRT-PCR法。用RNA提取试剂盒提取各组织样本中的RNA，逆转录成cDNA。RNA经预变性后，按照逆转录体系配制逆转录反应液，反应条件为：37℃15 min，98℃5 min，-20℃保存。qRT-PCR反应条件为：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环；95℃1 min，55℃1 min，95℃30 s。采用2ΔΔCt法分析基因的相对表达。使用Premier 5.0软件设计PCR引物，OPG基因（NCBI ID：4982）上游引物序列为：5′-GCGCTCGTGTTTCTGGACA-3′，下游引物序列为：5′-AGTATAGACACTCGTCACTGGTG-3′；TNF-α基因（NCBI ID：7124）上游引物序列为：5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′，下游引物序列为：5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′；β-actin基因（NCBI ID：60）上游引物序列为：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物序列为：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α蛋白表达水平的检测

1.4.1 Western blot法 取直径约1 cm大小的组织，加入1 mL蛋白裂解液，使用组织匀浆器研磨组织，离心取上清，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。取25 μg蛋白样品，经10% SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，以5%脱脂牛奶室温封闭90 min；加入兔抗OPG、TNF-α多克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5 000稀释），室温孵育90 min；用TBST溶液洗膜3次，每次10 min；配制化学发光液，使用Tanon全自动化学发光图像分析系统检测蛋白表达。以β-actin为内参。

1.4.2 免疫组化法 组织石蜡包埋，切片（厚度3 μm），脱蜡、水化、抗原修复2 min，加入3%H2O2，孵育20 min；PBS洗涤3次，切片甩干，加入OPG（1∶200稀释）和TNF-α（1∶200稀释）抗体，37℃孵育60 min；PBS洗涤3次，加入通用性组化二抗，37℃孵育20 min；PBS洗涤3次，甩干，加入DAB显色剂，显微镜下观察，出现阳性指标终止显色，蒸馏水冲洗后衬染，苏木素染色1 min后水洗，1%盐酸酒精分化数秒，水洗，碳酸锂蓝化1 min后水洗，最后脱水、透明、封片。阳性判断标准：通过不同染色识别胎盘中OPG与TNF-α蛋白的表达，主要分为淡黄色、深黄色或棕黄色、棕褐色，随机观察5个高倍视野。分级标准：染色强度（阳性染色指标分类：1分为淡黄色，2分为深黄色或棕黄色，3分为棕褐色）；阳性细胞百分比（阳性百分比指标分类：0分为＜5%，1分为5%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%）。上述两者相加之和判定结果为：0～2分为阴性，3～5分为弱阳性，6～8分为中度阳性，9～12分以上为强阳性。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，组间比较采用χ2检验，应用Spearman秩相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般生理指标的比较 与对照组比较，试验组孕产妇血压显著升高（χ2分别为4.18和3.25，P＜0.05），新生儿出生体重显著降低（χ2=6.53，P＜0.05）；但孕产妇的年龄、体重、体重指数（body mass index，BMI）及孕周差异均无统计学意义（χ2分别为4.21、4.35、2.16和0.36，P＞0.05）。见表1。

表1 两组孕产妇一般生理指标的比较（±s）Tab.1 General physiological indexes of pregnant women in two groups（±s）

表1 两组孕产妇一般生理指标的比较（±s）Tab.1 General physiological indexes of pregnant women in two groups（±s）

注：a表示与试验组比较，P＜0.05。

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2.2 PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α基因mRNA表达水平qRT-PCR结果表明，试验组胎盘组织中OPG基因mRNA表达水平（0.34±0.02）显著低于对照组（0.69±0.04）（P＜0.000 1），而TNF-α基因mRNA表达水平（0.39±0.10）则显著高于对照组（0.16±0.05）（P=0.000 1）。

2.3 PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α蛋白表达水平

2.3.1 Western blot法 试验组胎盘组织中OPG蛋白表达水平显著低于对照组，而TNF-α蛋白表达水平则显著高于对照组，见图1。

图1 Western blot分析两组胎盘组织中OPG和TNF-α蛋白的表达情况Fig.1 Western blotting of OPG and TNF-α expressions in placenta tissues in two groups

2.3.2 免疫组化法 对照组胎盘组织中OPG蛋白免疫组化染色多为阳性表达，呈弥漫性分布，有时成团或块状聚集；而试验组胎盘组织中则呈低表达或不表达。对照组和试验组阳性表达率分别为80.6%（29／36）和35.0%（21／60），两组之间差异有统计学意义（χ2=18.71，P＜0.001）。见图2。

对照组胎盘组织中TNF-α蛋白免疫组化染色多为弱阳性或无表达，而试验组胎盘组织中则呈中度或高表达。试验组和对照组阳性表达率分别为71.7%（43／60）和27.8%（10／36），两组之间差异有统计学意义（χ2=17.53，P＜0.001）。见图2。

图2 免疫组化法分析两组胎盘组织中OPG和TNF-α蛋白的表达情况（×400）Fig.2 Immunohistochemical assay of OPG and TNF-α expressions in placenta tissue of two groups（×400）

2.3.3 PE患者胎盘组织中OPG与TNF-α蛋白表达的相关性Spearman分析显示，6例PE患者胎盘组织中OPG和TNF-α蛋白表达均阳性，2例均阴性，OPG与TNF-α蛋白表达呈负相关（rs=-0.702，P＜0.001）。见表2。

表2 PE患者胎盘组织中OPG与TNF-α蛋白表达的相关性分析Tab.2 Correlation of OPG and TNF-α expressions in placenta tissue of patients with PE

3 讨论

PE是妊娠期特有疾病，发病机制主要与血管内皮细胞损伤、子宫螺旋动脉重构不足、炎症免疫激活与亢进、氧化应激反应、脂质代谢紊乱等密切相关［4］，其病因和发病机制可能是多种易感因素促进、多信号通路激活、多触发机制致病相互作用的结果［5］。病理生理学检测结果表明，PE结局为血管痉挛及内皮损伤，最终导致多脏器多系统功能损害。

本实验正常妊娠胎盘组织中的OPG无论是在mRNA水平还是蛋白水平的阳性表达率均显著高于PE组，提示OPG可能对PE患者血管炎症刺激起抑制作用，对血管内皮细胞损伤起保护和修复作用，反之，其在胎盘组织中表达量下降可能会加重血管炎性病变，促进PE疾病进展，这是由于OPG不仅具有骨保护功能，其在保护血管内皮细胞、调节血管功能方面也起重要作用，机制可能与OPG配体、NF-κB配体受体激活剂（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和TNF相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的相互作用以及炎症与凋亡的双向调节密切相关。有研究证实，OPG表达水平与血管内皮损伤及钙化相关，进而与血管和重要器官的损害密切相关［6-7］。OPG可通过抑制炎症因子释放，从而减少对血管内皮的损伤；还可通过加快内皮细胞增殖，促进血管内皮修复，起到保护血管及避免血管内皮损害的作用，其发生机制可能是通过抑制TRAIL与其受体结合发挥上述作用［8］。OPG还可通过调节血管活性，促进有益血管活性因子释放，从而减少血管钙质沉积，减轻炎症反应，从而起到保护血管的作用［9-10］。但OPG对PE患者血管炎症的具体作用机制尚需进一步阐明。

TNF-α作为炎性细胞因子，由多种细胞合成分泌，其在炎细胞激活与级联释放、细胞免疫应答、维持细胞稳态、肿瘤血管发生及炎症感染等方面起重要作用［11］。本研究发现，在PE患者胎盘组织中，TNF-α在mRNA及蛋白水平的表达均显著增高，提示其可能引起胎盘血管炎性反应，导致内皮细胞损害，最终导致PE疾病进展。这是由于TNF-α可参与炎症细胞代谢及细胞增殖、分化与凋亡等，TNF-α在PE胎盘组织中的表达明显增加，导致血管内皮细胞损伤增加，NF-κB信号传导通路在其中发挥重要作用，该通路被激活后，可促进炎症相关靶基因的表达及TNF-α表达上调，造成血管内皮损伤、血流动力学改变、新生血管形成等一系列病理变化［12-13］。此外，TNF-α还可通过正反馈进一步激活NF-κB通路，加重血管内皮细胞的炎症反应和损伤，促进疾病发展［14］。

由于OPG与TNF-a在PE发病机制中的作用鲜有报道，本研究探讨了两者是否存在相关性，结果表明，OPG与TNF-a在PE病程中呈负相关，这是由于OPG可通过抑制RANKL的分泌进而抑制NF-κB信号通路，下调下游炎性细胞因子产生，并诱导炎症细胞凋亡，显示了抗炎活性［15-16］；TNF-α可通过激活NF-κB信号传导通路，促进多种炎症因子激活与活化，引起细胞损害［17-19］，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究结果提示，OPG与TNF-a在PE发病中呈负相关，可能与PE疾病发生发展密切相关，有望成为PE临床早期诊断和疾病监测的辅助参考指标之一。