河北地区汉族心脑血管病患者ApoE和SLCO1B1基因多态性分析

何莎 苟东芸 王文远 刘紫倩 杨洁 王彦永 孙静娜 张令怡 马晓伟

目前脑卒中仍然是世界范围内病死率较高的主要疾病［1］，其中缺血性卒中是由脑局部血液循环障碍所致中枢神经功能缺损综合征，高脂血症、动脉粥样硬化、吸烟、高血糖及高血压等疾病或不良嗜好是其重要危险因素。研究证实，缺血性卒中的发病过程受相关基因调控［2］，载脂蛋白E（ApoE）基因多态性则可能是其重要危险因素之一［3］。既往研究表明，ApoE基因多态性与缺血性卒中的发生存在相关性，尤其是携带ε4等位基因的亚洲人群发生缺血性卒中的风险明显高于白种人［4-5］。他汀类药物作为预防心脑血管病的重要药物，在临床上被广泛应用［6］，但其降脂效果及患者临床结局存在较大的个体差异，这种差异的部分原因可能与遗传因素相关［7］，近年较受关注的基因类型即ApoE和SLCO1B1基因。研究表明，SLCO1B1基因单核苷酸多态性（SNP）可通过改变药物代谢酶和药物转运蛋白的转运活性而影响药物的血清浓度，诱发肌肉病。本研究采用聚合酶链反应（PCR）-荧光探针法从分子水平对河北地区汉族人群中心脑血管病患者ApoE和SLCO1B1基因多态性的分布特征进行分析，以为实现基因检测手段服务于脑卒中的防治及他汀类药物精准治疗提供理论依据。

对象与方法

一、研究对象

1.纳入标准（1）年龄17～100岁。（2）籍贯为河北地区汉族居民，无血缘关系以及异族通婚史。（3）依据《心血管内科疾病诊疗指南》［8］和《中国各类主要脑血管病诊断要点2019》［9］确诊合并心血管病或脑血管病。（4）本研究经河北医科大学第一医院伦理委员会审批（批准号：20190418），患者及其家属对研究项目知情同意并签署知情同意书。

2.排除标准（1）未检测到基因表型者。（2）有肝、肾、血液系统等严重原发性疾病或肝功能异常者。（3）近3个月内参加其他临床试验者。

3.一般资料选择2018年6月至2019年10月在我院神经内科和心内科就诊的4193例心脑血管病患者，男性2314例，女性1879例；年龄31～97岁，平均（64.12±12.18）岁。

二、研究方法

1.仪器与试剂全自动核酸提纯及荧光PCR分析仪Anadus9850、血液基因组DNA提取试剂盒均购自厦门安普利生物工程有限公司；人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒（批号：19052008，PCR-荧光探针法）由武汉友芝友医疗科技股份有限公司提供。

2.基因组DNA提取抽取患者晨起空腹静脉血2 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，严格按照试剂盒说明书提取基因组DNA，同时，设置弱阳性对照和空白对照。分别于2 ml基因组DNA（5～15 ng/μl）、弱阳性对照及空白对照管中滴加4种PCR反 应 液（SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4），进行PCR扩增。PCR反应总体系为25 μl［缓冲液、特异性引物和探针、内标引物、探针和模板、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）］，配制后于离心半径4.83 cm、2650 g/min离心2 min；反应条件为37℃10 min、95℃5 min；95℃15 s、60℃45 s，共40个循环。

3.PCR-荧光探针法扩增基因组DNA及信号采集按照以下条件进行PCR反应，UNG酶处理阶段：37℃10 min循环1次；预变性阶段：95℃5 min循环1次；PCR阶段：95℃15 s、60℃45 s，共循环40次，于60℃时进行数据采集，荧光信号的收集定为FAM（SLCO1B1*1b388A、SLCO1B1*5521T、ApoEɛ2526C、ApoEɛ4388T）、VIC（SLCO1B1*1b388G、SLCO1B1*5521C、ApoEɛ2526T、ApoEɛ4388C）和ROX（内标）。根据不同等位基因数目和等位基因总数计算基因频率：已知基因型个体数，计算某基因频率=［该基因总数（A）/该基因及其等位基因的总数（A+a）］×100%；已知基因型频率求某一等位基因的频率＝该等位基因纯合子的频率（AA）+1/2×杂合子的频率。

4.统计分析方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理与分析。计数资料以相对数构成比（%）或率（%）表示，ApoE和SLCO1B1基因多态性位点是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡和组间基因型分布的差异性，行χ2检验。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、ApoE和SLCO1B1基因多态性等位基因频率及基因型分布

分析结果显示，河北地区汉族心脑血管病患者ApoE及SLCO1B1基因多态性位点突变频率观察值符合Hardy-Weinberg遗传平衡，提示该样本来自同一总体，具有群体代表性（表1）；且男女之间ApoE基因多态性位点388T＞C、526C＞T，SLCO1B1基因多态性位点388A＞G、521T＞C分布差异无统计学意义（P＞0.05；表2，3）。

表1 ApoE和SLCO1B1基因等位基因频率及Hardy-Weinberg平衡检验Table 1.Allele frequency of ApoE and SLCO1B1 genes and the test of Hardy-Weinberg balance

表2 不同性别心脑血管病患者ApoE基因多态性频率分布的比较［例（%）］Table 2.Frequency distribution of ApoE genotypes of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

二、基因多态性分布

1.ApoE基因多态性分布河北地区汉族心脑血管病患者ApoE基因的6种表型中，以ɛ3/ɛ3、ɛ3/ɛ4所占比例最高，分别为68.57%（2875/4193）、15.48%（649/4193）；ɛ2/ɛ2、ɛ2/ɛ3、ɛ2/ɛ4、ɛ4/ɛ4比例为0.48%（20/4193）、12.81%（537/4193）、1.69%（71/4193）和0.98%（41/4193）。不同性别之间ApoE各表型差异无统计学意义（χ2=6.971，P=0.223；表4）。

表4 不同性别心脑血管病患者ApoE基因表型分布［例（%）］Table 4.Genotypes of ApoE gene of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

2.SLCO1B1基因多态性分布河北地区汉族心脑血管病患者SLCO1B1基因的7种表型之中，*1a/*1a、*1b/*1b、*1a/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*15/*15所占比例分别为7.20%（302/4193）、39.57%（1659/4193）、31.05%（1302/4193）、0.02%（1/4193）、6.42%（269/4193）、14.31%（600/4193）和1.43%（60/4193）。不同性别之间SLCO1B1基因表型差异无统计学意义（χ2=11.354，P=0.078；表5）。

表5 不同性别心脑血管病患者SLCO1B1基因表型分布［例（%）］Table 5.Genotypes of SLCO1B1 gene of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

讨 论

脑卒中是一种受多基因、多因素影响的脑血管病，其中遗传和环境因素共同影响其病理生理学机制［3］。研究显示，中国汉族人群中ApoEɛ4等位基因及ɛ2/ɛ4、ɛ3/ɛ4、ɛ4/ɛ4基因表型可能是缺血性卒中的危险及遗传易感因素［10］。他汀类药物是目前防治冠心病、脑卒中及高脂血症等疾病的首选药物，但其降低胆固醇的幅度仍然存在很大的个体差异，约有1/3的患者经调整调脂药物后仍达不到降脂目标［11］，这种降低胆固醇的效果表现出相对较大的个体差异，与患者的病情、治疗依从性及遗传因素有关［12］。研究发现，SLCO1B1基因的常见变异与他汀类药物引起的肌病密切相关，SLCO1B1基因突变可增加他汀类药物的血浆浓度，从而导致肌病的发生风险上升［13-14］。

ApoE是一种存在于血浆中可以参与脂蛋白运输和代谢、脑磷脂代谢及维持神经细胞间脂类代谢的载脂蛋白［15］。ApoE有两种常见单核苷酸多态性，526C＞T和388T＞C，二者共形成3种等位基因（ɛ2、ɛ3、ɛ4）和6种基因表型（ɛ3/ɛ3、ɛ3/ɛ4、ɛ2/ɛ3、ɛ2/ɛ4、ɛ4/ɛ4、ɛ2/ɛ2）［16］。本研究显示，不同性别间ApoE基因单核苷酸多态性位点388T＞C、526C＞T分布及基因表型分布差异无统计学意义，提示ApoE基因多态性与性别无关。大量研究结果表明，ApoEε4可能是中国汉族人群缺血性卒中的重要遗传因素［10，17-18］，Jin等［17］对汉族人群ApoE基因多态性和缺血性卒中相关性进行观察，发现与ApoE3/3型受试者相比，ApoE4/4携带者发生缺血性卒中的风险增加2.1倍，且缺血性卒中组患者ApoEɛ4等位基因频率明显高于对照组，表明ε4是中国汉族人群缺血性卒中的危险因素，其与缺血性卒中病情进展密切相关［17-18］。

表3 不同性别心脑血管病患者SLCO1B1基因多态性频率分布的比较［例（%）］Table 3.Frequency distribution of SLCO1B1 genotypes of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

以往研究显示，不同民族之间ApoE基因多态性的基因型频率和等位基因频率存在差异［19］。本研究对河北地区汉族心脑血管病患者的观察显示，ApoEɛ4等位基因频率所占比例为9.56%（802/8386），ɛ3和ɛ2的比例分别为82.71%（6936/8386）和7.73%（648/8386；而与ɛ4相关的基因表型ɛ3/ɛ4、ɛ2/ɛ4、ɛ4/ɛ4占比分别为15.48%（649/4193）、1.69%（71/4193）和0.98%（41/4193），与中国南部客家族［20］及华中地区汉族人群［21］的研究结果相似，提示河北地区汉族心脑血管病患者中约20%的人存在罹患缺血性卒中的潜在风险。对此类人群应该进行健康教育宣传并尽早做好预防，从而避免缺血性卒中的发生。

SLCO1B1基因是指导合成有机阴离子转运多肽1B1（OATP1B1）的基因，其多态性可以导致OATP1B1的转运功能下降并可增加药物不良反应，SLCO1B1基因位点有两个常见、非同义单核苷酸多态性位点显示药物运输功能改变，分别是521T＞C和388A＞G［14］。两种单核苷酸多态性共形成4种单倍型（*1a、*1b、*5、*15）以及9种表型（*1a/*1a、*1b/*1b、*1a/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*15/*15、*5/*5、*5/*15）。本研究仅检测到7种表型，未检测到*5/*5和*5/*15，且不同性别之间SLCO1B1基因单核苷酸多态性位点388A＞G、521T＞C分布及基因表型分布差异并无统计学意义，提示SLCO1B1基因多态性与性别无关。SLCO1B1基因的功能突变（包括SLCO1B1单核苷酸多态性388A＞G、521T＞C）在世界各地均以高频率广泛分布，且在群体内部的多样性大于在群体之间的多样性［22］。本研究纳入的河北汉族心脑血管病患者，SLCO1B1388A＞G与521T＞C基因突变频率分别为74.04%（6209/8386）和11.81%（990/8386），与中国南方客家族的74.18%（1362/1836）和10.95%（201/1836）［20］，以及华中地区汉族人群的74.99%（4873/6498）和12.37%（804/6498）［21］突变频率相似。与国外相关人群相比，河北地区汉族心脑血管病患者SLCO1B1388A＞G基因突变频率与非洲人群相近（70%～80%），且高于高加索人群（30%～45%）。相比中国汉族人群，SLCO1B1521T＞C基因突变在美国、中东及欧洲人群中发生频率较高，分别为24%、20%和18%，但在撒哈拉以南非洲的突变频率（1.9%）较低［22］。

既往研究表明，SLCO1B1521T＞C可增加他汀类药物（如辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀）治疗人群发生相关肌病的风险［23］。这是由于SLCO1B1521T＞C基因突变使OATP1B1的转运活性降低，导致许多他汀类药物尤其是活性辛伐他汀酸的血药浓度显著升高，使辛伐他汀诱发肌肉病的风险随之增加，从而降低辛伐他汀的治疗效果［24］。他汀类药物引起的不良反可能与SLCO1B1基因多态性及他汀药物种类有关，但也有部分学者认为SLCO1B1521T＞C基因突变不会增加肌病的发生风险［25-26］。在本研究中，SLCO1B1521 TC（杂合突变）和CC（纯合突变）型所占比例分别为20.75%（870/4193）、1.43%（60/4193），521T＞C基因突变频率为11.81%（990/8386），提示河北地区汉族心脑血管病患者中有近20%的人存在罹患他汀药类物相关性肌肉病风险，对于此类用药患者应尽量监测并避免其发生相关不良反应。对湖北省汉川市汉族人群SLCO1B1基因多态性与缺血性卒中相关性的研究提示，SLCO1B1基因rs4149056位点多态性可能与缺血性卒中有关，TC和CC基因型人群可能更容易罹患缺血性卒中，等位基因C可能是脑卒中的易感基因［27］。

综上所述，河北地区汉族心脑血管病患者中可能有近20%的人存在发生缺血性卒中和他汀类药物相关性肌肉病的风险，携带SLCO1B1*5或*15等位基因的患者应避免服用高剂量他汀类药物。对不同地区的人群进行ApoE和SLCO1B1基因多态性检测可从分子水平揭示其与疾病易感性的关系，为不同地区预防缺血性卒中及实现他汀类药物精准治疗提供理论依据。

利益冲突无