PDGFB基因多态性与鼻咽癌易感性的相关性分析

丁科，卢诗丽，刘洁兰，莫丽梅，仇雯丽，唐任光，唐玉莲

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院检验学院，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种起源鼻咽黏膜的上皮源性恶性肿瘤，主要致病因素包括环境、遗传和EB病毒(epstein-barr virus)，恶性程度高，而且易较早出现颈部淋巴结转移，严重危及人类的生命和健康[1]。NPC的流行病学特点较为独特，在全球的地域分布存在不均衡的现象，好发于我国南部地区以及东南亚，近几十年来，NPC的发病率和死亡率呈现下降的趋势，但是据统计分析显示我国NPC的发病率和死亡率在世界范围内仍处于较高水平[2-3]。目前NPC的确切发病机制尚不明确，针对NPC的遗传基因多态性成为近年来的研究热点和重点[4-6]。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)参与调节多种生理和病理生理过程，并且与肿瘤预后不良有关[7]。PDGFB基因是PDGF家族中的一员，现有报道，PDGFB基因与多种肿瘤相关[8-9]，但是，目前关于PDGFB基因在NPC中的表达及作用较少报道，故本文将探究PDGFB基因rs1800817和rs1800818的多态性与NPC患病易感性关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 采用病例对照研究方法，收集右江民族医学院附属医院确诊的NPC患者和健康体检者全血标本。NPC患者共120例，其中男85例，女35例，年龄(47.76±10.22)岁。健康体检对照者共126例，其中男62例，女64例，年龄(42.94±12.89)岁。本研究方案通过右江民族医学院附属医院的医学伦理委员会审批，受试者均知情后签署同意书。

1.2纳入及排除标准 病例组患者经过临床病理组织活检确诊，尚未接受放、化疗治疗，并且排除合并其它原发和继发肿瘤。对照组的研究对象为身心健康者，排除心血管及肝肾等疾病，临床和实验室检查各项指标均正常。本研究所有研究对象均为本地户籍，且长期居住本地。

1.3方法

1.3.1基因组DNA分离 采集研究对象的清晨空腹肘部正中新鲜静脉血3 ml，使用基因组DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]对血液样品进行DNA抽提，严格按照说明书方法，使用Qubit 2.0对获得的DNA进行浓度和纯度测定，并低温保存。

1.3.2多重PCR扩增及高通量测序 设计并合成一个包含45个SNPs位点的引物池，分两步PCR完成目标SNP位点序列的扩增和兼容Illumina测序文库的制备。第一轮PCR反应体系：总体积25 μl，其中DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，2×PCR Ready Mix 15 μl，无核酸酶水补足25 μl，使用1%的琼脂糖胶电泳检测PCR产物，确定产物大小正确，并用AMPure XP磁珠纯化回收PCR产物，进入第二轮PCR反应：总体积30 μl，其中DNA 2 μl，P7引物1 μl，P5引物1 μl；2× PCR Ready Mix 15 μl，无核酸酶水补足30 μl。最终PCR产物使用AMPure XP磁珠纯化回收，各个PCR产物等量混合后，使用HiSeq XTen测序仪(Illumina，San Diego，CA)进行测序。

1.3.3基因分型分析 使用cutadapt (v 1.2.1) 软件切除任何含有测序接头序列的部分序列，剩余序列使用PRINSEQ-lite(v 0.20.3)软件进行质控，依照序列的3′端往5′端的顺序，删除质量阈值低于20的碱基，余下序列视作质控合格的序列，并使用BWA(v 0.7.13-r1126)软件将其比对到参考基因组上，参数为默认参数，最后根据比对结果，通过samtools软件(版本0.1.18)计算目标位点的基因型结果，并使用Annovar(2018-04-16)软件用于对突变位点进行基因注释。

1.3.4不同种族人群基因多态性的分布比较 通过ensembl在线数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)，获得北京汉族人群(CHB)、欧洲人群(EUR)、日本人群(JPT)、非洲人群(AFR)、美国人群(AMR)和南亚人群(SAS)的基因型和等位基因分布频率，并与126名健康人群比较。

1.4统计学方法 运用统计软件SPSS 17.0分析实验数据，Logistic回归用于分析基因型和等位基因型分布频率与NPC易感性的关系。基因型频率是否符合哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)遗传平衡定律采取拟合c2检验判断人群代表性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1基因型遗传平衡评估PDGFB基因 rs1800817位点的基因型有TT、GT和GG型，rs1800818位点基因型有TT、CT和CC型。经检验，PDGFB基因rs1800817和rs1800818位点基因型符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，群体具有代表性，见表1。

表1 rs1800817和rs1800818基因型分布hardy-weinberg平衡检验

2.2基因型与NPC易感性的相关性PDGFB基因rs1800817和 rs1800818位点基因型和等位基因在两组中差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 鼻咽癌 SNP基因型和等位基因在NPC组与对照组的比较

2.3rs1800817和 rs1800818位点多态性与性别的相关性 男性rs1800817位点TT基因型和rs1800818位点TT基因型在两组中差异有统计学意义(P<0.05)，而不同性别rs1800817位点和rs1800818位点其他基因型在两组中差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 rs1800817和rs1800818与性别对鼻咽癌发病的影响

2.4rs1800817和rs1800818位点单倍型分析PDGFB基因rs1800817和rs1800818位点存在GC、GT、TC及TT 4种单倍型，各单倍型在NPC组和对照组中的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 rs1800817和rs1800818单倍型在NPC组和对照组中的比较

2.5rs1800817和rs1800818多态性与NPC临床病理的相关性PDGFB基因rs1800817和 rs1800818位点基因型和等位基因分布频率与NPC的组织类型、临床分期、淋巴结转移和远处转移差异无统计学意义(P>0.05)，见表5、表6。

表5 rs18008187多态性与NPC患者的临床病理特征关系

表6 rs1800818多态性与NPC患者的临床病理特征关系

2.6广西人群rs1800817和 rs1800818位点与不同地区人群比较 广西人群PDGFB基因rs1800817和 rs1800818位点基因型和等位基因频率与欧洲人群(EUR)、日本人群(JPT)、非洲人群(AFR)、美国人群(AMR)及南亚人群(SAS)之间差异均有统计学意义(P<0.05)，但与北京汉族人群(CHB)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表7。

表7 rs1800817和 rs1800818在不同地区人群的分布频率

3 讨论

PDGFB是PDGF家族四种成员之一，以二聚体形式存在[10]。目前研究认为，PDGF家族成员的过表达与肿瘤细胞的黏附迁移、血管发生、血管形成以及转移浸润之间关系密切[11]。PDGFB可作用于血管周围细胞，包括血管周细胞和平滑肌细胞，并诱导其迁移至新生的血管网中，促进血管的成熟和重塑[12]。PDGFB还可以引起肿瘤细胞形态和免疫表型的改变，在神经胶质前体细胞的迁移增殖、分化和生长中起重要作用[13]。研究表明，围手术期血清PDGFB指标低的肝癌患者，术后早期肝癌复发率较高[8]。此外，PDGFB在卵巢肿瘤和间质细胞中均有表达，并且与卵巢肿瘤的预后呈负相关[9]。另有研究表明，作为PDGF家族成员之一，PDGFA可能通过多种途径参与NPC的发生、发展和迁移[14]，而PDGFB的高表达与口腔、食管鳞癌的预后不良有关[15-16]。

我国NPC的患病人群分布呈现明显的地域性，而且广西地区男性患病率高于女性[17]。本研究结果发现，PDGFB基因rs1800817和rs1800818位点基因型和等位基因可能与桂西地区人群NPC的致病并无关联。我们进一步探讨不同性别PDGFB基因rs1800817和rs1800818位点多态性的差异，结果发现，PDGFB基因rs1800817和rs1800818位点TT基因型与桂西地区男性NPC致病相关，可增加对NPC的易感性。对于这一结果原因的分析，可能与男性患者吸烟史、工作生活环境压力有关；另外，有研究表明桂西地区不同性别鼻咽癌患者EB病毒抗体水平之间存在差异[18]，是否不同性别间感染EB病毒会增加男性致病性，仍需要进一步研究。

此外，我们研究发现，广西人群PDGFB基因rs1800817和rs1800818位点多态性与日本、非洲、欧洲、美国及南亚人群差异均有统计学意义，而与我国北京地区汉族人群差异无统计学意义，这一结果表明，这两个位点在不同种族及地域间存在较强的差异。由于不同地域人群、生活习惯等差异，基因多态性也存在差异性，这种差异性往往与疾病的易感性相关，而且会导致疾病的转归及预后不同。例如，Ben-Ari Z等[19]发现PDGFB基因rs1800817位点多态性与肝移植后严重的HCV复发感染有关，并且在肝纤维化的发生发展中起重要作用。Stremitzer S等[20]发现PDGFB基因rs1800818位点多态性与结直肠肝转移患者术后接受贝伐单抗化疗3年总存活率有关。

综上所述，本研究发现PDGFB基因rs1800818和rs1800817位点多态性存在着地域和种群的差异，并且其TT基因型与桂西地区男性NCP发病存在一定的相关性。然而，本研究尚存在一些不足，如尚未研究基因与环境的影响以及周围组织浸润的关系；其次，本研究的样本量较小。因此，进一步扩大样本量深入探讨PDGFB基因多态性与NPC易感性的关系，将有益于了解NCP的发病机制。