探讨IL-18BP对卵巢癌的保护作用及可能被调控的机制

秦爱玲，梁丹

(广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

卵巢癌是较常见的妇科恶性肿瘤，据国际权威杂志CA Cancer J Clin发布2020年全球癌症统计数据显示，卵巢癌的新发病率和死亡率均排在妇科恶性肿瘤的第二位，仅次于宫颈癌[1]。

IL-18是IL-1细胞因子家族的一员，可通过促进天然免疫细胞增殖和激活，抑制各种肿瘤的反向发展，在抗肿瘤研究方面被广泛研究[2]。在各种人肿瘤组织微环境中均有分泌型IL-18结合蛋白IL-18BP的表达，通过抑制IL-18的功能，限制其免疫治疗的功效[3]。有报道称，虽然IL-18BP可以表达于原代培养的卵巢癌细胞和患者的血清、腹水中，但在卵巢癌细胞系中没有表达。IL-27是IL-12家族成员，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖和侵袭转移[4-8]，还可通过活化STAT1促进卵巢癌细胞系中IL-18BP的mRNA转录[9]。然而，IL-18BP在卵巢癌中的作用尚不明确。作为关键的免疫检查点，程序性死亡配体1(PD-L1)通过与其受体-细胞膜上的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)相互作用来抑制抗肿瘤免疫。阻断PD-L1/PD-1相互作用可显著增强抗肿瘤免疫应答，是癌症治疗的重大突破。对PD-1和PD-L1的阻断可以适当激活NK细胞和CD8阳性T细胞，提高对卵巢癌免疫治疗的效果[10]。在卵巢癌中IL-27也可以通过激活JAK-STAT通路，上调PD-L1的表达[11]。

本文将深入探讨IL-18BP与卵巢癌发病的关联，分析PD-L1与IL-18BP之间可能存在的相互作用关系，为更好地解析 IL-18BP对卵巢癌发病的影响提出可信的依据。

1 材料与方法

1.1数据资料来源与分组处理 本研究数据来源于UCSC网站(http://xena.ucsc.edu/)整理的TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中卵巢癌样本信息(GDC TCGA Ovarian Cancer)以及GTEx数据库中(https://www.gtexportal.org/home/index.html)正常卵巢样本信息，包括卵巢癌样本和正常卵巢样本的全基因转录组测序结果(RNA-seq)、卵巢癌患者的总生存时间文件(survival data)以及临床性状信息文件(Phenotype)。将TCGA与GTEx下载的RNA-seq数据均进行Log2(FPKM+1)转换。进行数据筛选，最终纳入该研究共有354例卵巢癌样本和88例正常卵巢样本，后续临床因素分析过程中由于TCGA数据库存有部分患者临床信息有缺失，故分析总例数有出现小于354例的情况。在纳入的卵巢癌患者样本中以IL-18BP的中位值进行分组，分为IL-18BP高表达组和IL-18BP低表达组，并利用此分组标准进行Kaplan-Meier生存分析和GSEA基因集富集分析。

1.2GSEA基因集富集分析 通过利用GSEA 3.0版本软件对纳入的卵巢癌样本进行基因富集分析，根据IL-18BP中位值进行表达高低分组，研究IL-18BP表达水平与肿瘤经典Hallmarks基因集和通路常用京都基因和基因组百科全书通路基因集(KEGG)的相关性。从Molecular Signatures Database数据库中下载h.all.v7.2.symbols和c2.cp.kegg.v7.2.symbols基因集作为参照基因集，软件参数设置排列次数为1000次，计算富集分数和标准化后的富集分数。按照标准化后富集分数进行排序，将P<0.05，FDR<0.05的基因集作为显著富集基因集。

1.3筛选在卵巢癌中和PD-L1表达正相关且与预后相关的基因 利用TCGA数据库中卵巢癌的RNA-seq数据，采用Pearson分析筛选与PD-L1表达相关基因，筛选条件为P<0.05，|R|>0.5；通过Kaplan-Meier生存曲线分析与多因素Cox(multiCox)分析筛选与卵巢癌独立预后基因；通过秩和检验筛选卵巢癌样本和正常卵巢样本间的差异基因；利用韦恩图(Venn)在线网页工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)筛选出满足和PD-L1表达相关、可作为卵巢癌患者独立预后且在肿瘤和正常样本间具有表达差异的基因。

1.4统计学方法 卵巢癌中与PD-L1表达相关的基因采用Pearson分析；筛选卵巢癌与正常样本的差异基因使用R语言软件4.0.2版本“limma”包，通过Wilcox秩和检验比较mRNA的表达水平；筛选独立预后因素使用R语言软件4.0.2版本“survival”包和“survminer”包，绘制Kaplan-Meier生存曲线和多因素Cox(multiCox)分析结果森林图；IL-18BP mRNA表达水平和临床性状信息相关性分析采用χ2检验。IL-18BP与PDL1表达对卵巢癌患者预后的影响通过Kaplan-Meier绘制生存曲线。P<0.05为具有统计学差异。Pearson判断显著性的|R|标准为>0.5，GSEA判断富集显著FDR值标准为<0.05。

2 结果

2.1IL-18BP在卵巢癌患者中的表达差异和生存分析 利用TCGA数据库和GTEx数据库联合分析，对88例正常卵巢组织样本和354例卵巢癌样本的IL-18BP mRNA表达进行分析(见图1a)，IL-18BP基因在肿瘤组织样本中和正常卵巢组织样本中表达水平统计学差异显著(P<0.05)，且IL-18BP在卵巢癌中的mRNA表达低于正常卵巢组织。

结合TCGA数据库中IL-18BP表达谱数据和生存数据，按照IL-18BP中位值分为高低表达两组患者，进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示IL-18BP高表达组相对于低表达组患者生存时间显著延长(P<0.05)(见图1b)；结合患者临床性状分析进一步进行多因素Cox分析，具有完整年龄、肿瘤分期、肿瘤分级以及IL-18BP表达量的患者共339例，结果显示IL-18BP和年龄可作为卵巢癌患者独立预后因素(图1c)，IL-18BP为独立保护性预后因素(HR=0.75，P<0.05)，年龄为独立危险性预后因素(HR=1.02，P<0.05)。

注： 图1a：TCGA数据库卵巢癌样本与GTEX数据库正常卵巢样本IL-18BP mRNA水平表达差异；图1b：TCGA数据库卵巢癌患者总生存KM曲线分析；图1c：TCGA数据库卵巢癌患者多因素Cox分析森林图。

2.2卵巢癌中IL-18BP基因表达水平和临床性状的关系 结合TCGA数据库中卵巢癌样本IL-18BP的表达谱数据和临床性状数据，具有完整年龄、肿瘤分期、肿瘤分级以及IL-18BP表达量的患者339例。利用χ2检验分析IL-18BP表达和临床性状的关系(见表1)，结果显示IL-18BP表达仅与肿瘤分期有关，IL-18BP的高表达和低表达在肿瘤分期方面比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与年龄(P=0.706)、肿瘤分级(P=0.064)无关。

表1 IL-18BP的mRNA表达水平和卵巢癌患者临床性状的关系

2.3IL-18BP的功能基因集富集 为了进一步研究IL-18BP在卵巢癌中发挥的作用机制，利用TCGA数据库中卵巢癌全基因组mRNA表达谱数据，通过GSEA方法分析IL-18BP的表达和肿瘤相关基因集与通路基因集之间的关联。在Hallmarks基因集库中，IL-18BP高表达组主要富集到细胞凋亡、补体系统、IL2/STAT5信号、同种异体排斥、炎症应答和干扰素γ应答等相关的基因集(见图2a)；在KEGG基因集库中，IL-18BP高表达组主要富集到趋化因子信号通路、自然杀伤细胞细胞毒活性、T细胞受体信号通路、细胞凋亡、细胞因子受体相互作用和JAK/STAT信号通路等相关的基因集(见图2b)。上述富集结果提示IL-18BP最有可能通过上述机制调控卵巢癌的进展。

注： 图2a：IL-18BP在Hallmarks基因数据集中GSEA富集分析结果；图2b：IL-18BP在KEGG基因数据集中GSEA富集分析结果。

2.4卵巢癌中筛选和PD-L1表达相关且与预后相关的基因 通过TCGA数据库中卵巢癌样本的RNA-seq数据，对全基因组和PD-L1的mRNA表达进行Pearson相关性分析筛选，筛选条件设定为P<0.05，|R|>0.5，共筛选出355个基因；结合TCGA卵巢癌样本的RNA-seq表达谱数据和相应的患者总生存时间与生存状态，利用Kaplan-Meier生存分析共筛选出3699个基因和卵巢癌患者生存相关，进一步对3699个基因利用多因素Cox筛选共筛选出25个基因，可作为卵巢癌患者独立预后因素，通过分析结果显示发现25个基因HR值均<1，表明上述基因为卵巢癌患者的独立预后保护因素；最后通过TCGA和GTEx数据库联合分析，共筛选出8083个差异基因。根据上述筛选条件，利用韦恩图对每一筛选条件所筛选出的基因进行取交集，得出共有两个基因满足上述条件，分别为IL-18BP和AC083862.02(见图3a)。利用GEPIA在线分析工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)显示IL-18BP与PD-L1的mRNA表达水平在卵巢癌中具有正相关(见图3b)。

注： 图3a：经相关性、临床预后及差异基因筛选基因；图3b：TCGA数据库IL-18BP与CD274 mRNA表达水平相关性分析。

2.5IL-18BP和PD-L1对卵巢癌患者预后的综合分析 同时分析TCGA数据库中卵巢癌患者中IL-18BP和PD-L1的表达，按照IL-18BP和PD-L1各自中位值可将卵巢癌患者分为4组(见表2)，结合相应的总生存时间和生存状态通过Kaplan-Meier生存分析(见图4)，结果显示IL-18BP和PDL1均高表达组较IL-18BP和PDL1均低表达组生存时间显著延长(P<0.05)。

表2 按照IL-18BP和PD-L1各自中位值将卵巢癌患者分组

图4 IL-18BP与PD-L1表达对卵巢癌患者总生存的KM曲线分析

3 讨论

免疫系统和癌症之间的相互作用由复杂的生物信号网络调控。尽管人们期望免疫系统会根据其独特的突变和适应特征，自动将癌细胞定义为“外来者”细胞并将其清除，然而免疫系统和癌症之间最重要的自然平衡是“耐受性”，即癌细胞被视为“自己人”。这种耐受性由多种机制维持，包括调节性免疫细胞、免疫抑制性细胞因子和趋化因子，以及下调免疫功能的免疫检查点[12-13]。PD-L1是最常见的免疫检查点，与PD-1形成受体-配体对，是肿瘤微环境中主要的免疫检查点通路。虽然理论上阻断该通路可以提高免疫细胞对肿瘤细胞的识别并加以清除，但这种阻断并非对每一种类型的肿瘤或每一个患者都有效[14]。已知除了PD-L1，还有CTLA4、IL-18BP等几十个免疫检查点。

IL-18是IL-1细胞因子家族的重要成员，介导NLRP3和NLRP1炎性小体下游的炎症反应[15]。IL-18是一种促炎和免疫调节细胞因子，其中还包括 IL-1α 和 IL-β、IL-33、IL-36α、IL-β、γ、IL-1Rα、IL-36Rα和IL-38[16]。与该家族的其他成员一样，IL-18 需要被Caspase-1加工后成为活体形式。IL-18BP是IL-18的可溶性抗体，最初是从人的尿液中被发现，在体外和体内阻断IL-18诱导的IFN-γ产生，表明IL-18BP是IL-18介导的免疫反应的天然负向调节因子[17]。多项研究表明，IL-18BP可以通过中和IL-18抑制其抗肿瘤作用[18-19]，提示IL-18BP具有促癌的作用。然而，我们在对卵巢癌的研究中发现，IL-18BP对于卵巢癌患者可能起到一个保护作用，主要体现为它的表达与患者的生存率呈正相关性(见图1b)，并且可以作为独立保护性因素存在(见图1c)。在分析IL-18BP与卵巢癌患者临床信息时发现，IL-18BP的表达水平与卵巢癌的临床分期有关(见表1)。以上结果均提示：在卵巢癌中，IL-18BP可能是一个保护性因子。

PD-L1是最常见的免疫检查点，与其配体PD-1结合可一定程度上抑制机体的细胞免疫反应，特别是可以造成肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视和杀伤，也就是免疫逃避。大多数研究认为PD-L1是一种跨膜蛋白，主要表达在细胞膜上。但深入研究发现，PD-L1不仅表达在细胞膜，还可能存在于外泌体和细胞微泡表面，甚至部分以游离形式存在，这些非细胞膜上的PD-L1统称为可溶性PD-L1[20]。虽然有报道称，阻断PD-1和PD-L1可以适当激活NK细胞和CD8阳性T细胞，提高对卵巢癌免疫治疗的效果[10]，但仍有报道称，Stat3磷酸化介导的PD-L1入核却可以通过诱导包括肺癌、乳腺癌、肝癌以及卵巢癌在内的多种肿瘤细胞焦亡，显著增强抗肿瘤免疫应答[21]。以上结果提示：PD-L1在细胞内不同的定位决定其完全不同的生物学功能。我们利用生物信息学分析卵巢癌中与PD-L1的相关基因表达时，发现IL-18BP与PD-L1具有最强的正相关性(见图3b)。对卵巢癌患者的生存率分析发现，虽然PD-L1的表达高低对患者生存率有一定影响，但主要的影响因素还是IL-18BP(见图4)。我们设想IL-18BP的这种对卵巢癌的保护作用可能是细胞核内的PD-L1在发挥作用，在今后的研究中我们将继续利用分子生物学手段进行进一步的研究证明。

综上所述，与其它肿瘤不同的是，IL-18BP对于卵巢癌患者可能起到一个保护作用，而这种保护作用决定于PD-L1在细胞中的定位。本研究提出的设想可能为解释IL-18BP在卵巢癌中的全新应用提供新的思路。