柱前衍生HPLC-UV法测定氯氮平片中乳糖的含量

陈 瑶 汤建新 唐 英,

1. 湖南工业大学

生命科学和化学学院

生物医用纳米材料与器件

湖南省重点实验室

湖南 株洲 412007

2. 湖南大学

化学化工学院

化学生物传感与计量学

国家重点实验室

湖南 长沙 410082

1 研究背景

氯氮平（clozapine）是常见的非典型抗精神病药物[1]。根据药物一致性评价的要求，制剂处方中原料药及各辅料的含量需与参比制剂（reference listed drug，RLD）保持一致。医药研发技术需要保密，因而医药企业只公示氯氮平参比制剂的辅料种类，并无辅料的相关用量。故利用逆向工程研究技术，测出相关辅料的含量，对氯氮平一致性评价项目的处方研究具有重要意义[2]。

乳糖是存在于大多数哺乳动物乳中的天然二糖，由半乳糖和蔗糖组成[3]。乳糖因其安全性高，广泛用于片剂和胶囊剂的填充剂或稀释剂[4]、静脉注射剂、冻干产品和婴儿食品配方中。不同粒度的乳糖具有不同的作用，如片剂湿法制粒及伴有研磨混合的过程时，宜选择细小粒度级别的乳糖，这样更易于与其他成分混合，也可更有效发挥黏合剂的作用[5]。氯氮平作为口服制剂，工艺配方中也需加入了一定比例的乳糖作为填充剂。乳糖作为氯氮平不可或缺的辅料，确定其含量，可为氯氮平片剂工艺处方的开发提供有效数据，从而加快氯氮平片剂的仿制速度。

乳糖无紫外吸收能力。目前其检测方法有碘量法[6]、滴定法[7]、酶解法[8]、比色法[9]、旋光仪法[10]、近红外光谱法[11-12]、拉曼光谱法[13]，以及高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）与示差折光检测器[14-18]、蒸发光散射检测器[19-20]、质谱检测器[8,21]、电喷雾检测器[22]等串联的方法。其中，碘量法、酶解法、滴定法、旋光仪法，这些方法存在操作复杂、技术要求高、测试时间长、灵敏度不足、准确度较低的问题；近红外光谱法及拉曼光谱法需结合化学计量学建立定量模型，模型的建立需要大量样品和预先测定目标值，成本较高；高效液相色谱与示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电喷雾检测器、质谱检测器等串联的方法具有灵敏度高等优点，但该类仪器设备昂贵，制约其在中小型医药企业的广泛应用。因此，发展一种成本低、快速、灵敏的乳糖检测技术具有重要意义。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone，PMP）可与乳糖发生衍生反应（见图1），其衍生产物具有较强的紫外吸收能力，从而可通过高效液相色谱-紫外检测器（ultraviolet absorption detector，UV）对乳糖进行间接检测[23-24]。目前，HPLC-UV普及率高且经济，实验操作简单，准确度高。虽然HPLC-UV广泛用于中药材、食品、生物材料中乳糖含量的检测，但其应用于仿制药业领域的报道尚少。

图1 乳糖和PMP反应过程及液相检测模拟Fig. 1 Lactose derivatization simulation with PMP and the detection principle of HPLC

综上所述，本研究利用PMP与乳糖进行衍生反应，再对衍生物（在245 nm处有紫外吸收）进行检测，间接定量分析氯氮平片中乳糖的含量。该方法具有简便、快速、专属性强、灵敏度高等优点，可满足氯氮平一致性评价中逆向工程研究的需求，进而加快仿制药的研发进程。

2 实验部分

2.1 主要设备与仪器、试剂与材料

1）设备与仪器

分析天平，XSE105DU型，瑞士Mettler Toledo集团；水浴锅，DF-101S型，郑州豫华仪器制造有限公司；高效液相色谱仪，Waters e2695-2998型，美国Waters公司；色谱工作站，Empower 3型，美国Waters公司；纯水仪，Exceed-Ad-32型，成都艾柯分析设备有限公司；超声清洗仪，SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司；pH计，PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

2）试剂与材料

乳糖、磷酸，均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、氨水，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；醋酸铵，分析纯，山东西亚化学工业有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国默克公司；氯氮平片参比制剂，批号为T17039，规格为25 mg，诺华集团；氯氮平片仿制样品，批号为190701、190705、190708，规格为25 mg，湖南中南制药有限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 色谱条件

采用Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.1 mol/L醋酸铵溶液，用磷酸调节溶液pH至5.5，流动相B为乙腈，流速为1.0 mL/min，检测波长为245 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL，按照表1进行梯度洗脱。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 HPLC mobile phase gradient elution condition

2.2.2 溶液配制

1）空白基质：按照自研氯氮平处方混合相关辅料制得（无乳糖）。

2）衍生溶液：精确称量2.000 76 g PMP至100 mL容量瓶，再加入甲醇经超声溶解，定容，摇匀，配制成质量浓度为20.007 6 mg/mL的衍生溶液。

3）衍生空白溶液：称量12.05 mg空白基质至50 mL容量瓶，精确加入4.0 mL 20.007 6 mg/mL的PMP衍生溶液、1.0 mL纯水和0.4 mL氨水，90 ℃水浴中衍生30 min，冷却至室温，用甲醇定容，摇匀，过滤，即得。

4）对照溶液：分别精确称量220.95 mg和220.43 mg空白基质至20 mL容量瓶中，分别向容量瓶中加入200.05 mg和199.97 mg乳糖，加适量的水经超声溶解，定容后作为储备溶液；再精确移取1.0 mL储备溶液、0.4 mL氨水、4.0 mL 20.0076 mg/mL的PMP衍生溶液至50 mL容量瓶中，90 ℃水浴中衍生30 min，冷却至室温，再用甲醇定容，摇匀，过滤，即得。

5）供试品溶液：随机选取2片氯氮平片（需称量质量）至20 mL容量瓶中，加适量的水经超声至完全溶解，定容后作为储备溶液；再移取1.0 mL上述储备溶液至50 mL容量瓶中，加入0.4 mL氨水和4.0 mL 20.007 6 mg/mL 的PMP衍生溶液，90 ℃水浴中衍生30 min，冷却至室温，用甲醇定容，摇匀，过滤，即得。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

移取1.0 mL 10.039 mg/mL的乳糖溶液和1.0 mL 2.5 mg/mL氯氮平溶液至50 mL容量瓶中，再加入4.0 mL 20.001 1 mg/mL的PMP衍生溶液和0.4 mL氨水，90 ℃水浴中加热30 min，取出冷却至室温，用甲醇定容，作为供试品溶液，用于色谱条件优化。供试品溶液经过衍生反应后，进行等度洗脱分离，结果显示衍生物保留时间约为22 min，氯氮平峰在35 min之内未出峰。为提高分析效率，将色谱条件调整为梯度洗脱，按照最佳梯度洗脱条件（见表1）进样，得到衍生目标峰、PMP和氯氮平的色谱峰如图2所示。衍生目标峰与PMP间分离度（R=7.0）良好，氯氮平峰在分析周期内得以洗脱，且分析时间适中。

图2 供试品样品的衍生色谱图Fig. 2 Chromatogram of the test sample derivatized by PMP

3.2 衍生条件的优化

3.2.1 催化剂氨水用量的优化

移取1.0 mL 10.008 mg/mL的乳糖溶液至50 mL容量瓶，再加入4.0 mL 20.003 4 mg/mL的PMP衍生溶液，做7份平行试样，分别加入0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,1.5, 2.0 mL的氨水，90 ℃水浴中加热30 min，取出冷却至室温，用甲醇定容。

不同体积的氨水（V1）对乳糖衍生目标峰峰面积的影响曲线如图3所示。由图可知，随着氨水用量的增加，衍生目标峰的峰面积呈现先增大后减小的趋势。当氨水体积为0.4 mL时，衍生目标峰的峰面积最大。所以氨水最优体积选择0.4 mL。

图3 乳糖衍生目标峰峰面积与氨水体积的关系图Fig. 3 The peak area of lactose’s derivative to different volume of ammonia

3.2.2 衍生试剂PMP用量的优化

移取1.0 mL 10.012 mg/mL的乳糖溶液至50 mL容量瓶，再加入0.4 mL氨水，做5份平行试样，分别加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mL质量浓度为20.000 3 mg/mL的PMP衍生溶液，90 ℃水浴中加热30 min，取出冷却至室温，用甲醇定容。

不同体积的PMP衍生溶液（V2）对乳糖衍生目标峰峰面积的影响曲线如图4所示。由图可知，随着PMP用量的增加，衍生目标峰的峰面积增加幅度不明显，呈现波动变化。但当PMP体积为4.0 mL时，衍生峰面积出现最大值，且当PMP体积为5.0 mL时，衍生峰面积明显减小。因此，最终选择PMP衍生溶液体积为4.0 mL。

图4 乳糖衍生目标峰峰面积与PMP衍生溶液体积的关系图Fig. 4 The peak area of lactose’s derivative to different volume of PMP

3.2.3 衍生温度的优化

移取1.0 mL 10.020 mg/mL 乳糖溶液至50 mL容量瓶中，再加入0.4 mL氨水和4.0 mL质量浓度为20.001 7 mg/mL的PMP衍生溶液，做5份平行试样，分别放置于50, 60, 70, 80, 90 ℃水浴中加热30 min，取出冷却至室温后，用甲醇定容。

不同衍生温度对乳糖衍生目标峰峰面积的影响曲线如图5所示。

图5 乳糖衍生目标峰峰面积与衍生温度的关系图Fig. 5 The peak area of lactose’s derivative to different temperatures

由图5可知，随着衍生温度的增加，衍生目标峰的峰面积不断增加；当水浴温度达到80 ℃时，衍生目标峰的峰面积达到平台期，说明该温度下衍生反应基本完成。但为使衍生反应彻底并降低结果波动性的影响，最终选择90 ℃作为衍生温度。

3.2.4 衍生时间的优化

移取1.0 mL质量浓度为10.000 7 mg/mL的乳糖溶液至50 mL容量瓶中，再加入0.4 mL氨水和4.0 mL质量浓度为20.002 mg/mL的PMP衍生溶液，做7份平行试样，90 ℃水浴中分别加热15, 20, 25, 30,35, 40, 50 min，取出冷却至室温，用甲醇定容。

不同衍生时间对乳糖衍生目标峰峰面积的影响曲线如图6所示。由图可知，在30 min前，衍生目标峰的峰面积不断增大；在30～40 min，峰面积呈现减小趋势；过了40 min，峰面积又呈现增大趋势。在50 min内，衍生目标峰的峰面积在30 min时达到最大值。故最优的衍生时间为30 min。

图6 乳糖衍生目标峰峰面积与衍生时间的关系图Fig. 6 The peak area of lactose’s derivative to different derivation time

3.3 实验方法的性能验证

3.3.1 系统精密度

按照2.2.2的方法配制对照溶液，重复进样对照溶液6针，计算6针衍生目标物的峰面积和保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.85%和0.08%，由此说明进样系统的精密度良好。

3.3.2 稳定性

按照方法2.2.2配制对照溶液和供试品溶液，将对照溶液和样品溶液在室温分别放置0, 2, 4, 8, 12, 24,36, 48 h后进样，计算衍生目标峰峰面积的相对标准偏差分别为0.38%和0.48%。该结果表明对照溶液和供试品溶液在室温48 h内稳定，后续批量制备溶液和进样可在室温48 h内完成。

3.3.3 专属性

图7为衍生空白溶液、对照溶液、氯氮平样品溶液的色谱图。由图可以看出，PMP、乳糖衍生目标物、氯氮平的保留时间分别为19.348 , 22.243, 29.484 min，各化合物之间分离度良好，且完全不干扰衍生目标峰，由此说明该方法专属性良好。

图7 衍生空白溶液、对照溶液、氯氮平样品溶液的色谱图Fig. 7 Chromatogram of derivative blank solution,control solution and clozapine sample solution

3.3.4 线性范围和定量限

以衍生目标物的峰面积为纵坐标，乳糖的质量浓度c（mg/mL）为横坐标，建立标准加入法的标准曲线（如图8），其线性回归方程为：y=41 856 509.560 5x+36 592.315 8，相关系数R2为0.999 4。实验结果表明，在0.060 4～0.399 7 mg/mL范围内，衍生目标物的峰面积与乳糖质量浓度呈良好的线性关系。再将乳糖储备溶液逐步稀释后进行衍生，直至信噪比（S/N）在10～20之间，得到乳糖定量限为0.32 μg/mL。

图8 乳糖衍生目标物的峰面积与浓度关系图Fig. 8 The peak area of lactose’s derivative to different concentration

同时，将该方法与其他一些报道的乳糖检测方法进行比较（见表2）。本方法不需要昂贵的设备仪器、实验操作简单、具有较宽的线性响应范围、准确度高，能满足氯氮平片中乳糖的检测要求。

表2 不同方法检测乳糖的检出限和线性范围Table 2 Detection limits and linear ranges of different methods for lactose detection

3.3.5 耐用性

将对照溶液和供试品溶液，分别按照流速（1.0±0.1）mL/min、柱温（30±5）℃、检测波长（245±2）nm改变色谱参数及换用不同品牌色谱柱进样对照溶液和供试品溶液，计算的乳糖含量相对标准偏差为1.04%，且目标峰无相关干扰，由此说明本方法的耐用性及抗干扰性良好。

3.3.6 回收率

取9份供试品溶液，按照高、中、低3个水平添加乳糖作为加标溶液，考察本方法的回收率，结果如表3所示。

表3 乳糖在空白基质中的加标回收率（n=9）Table 3 Spiked recoveries of hydrazine in blank substrate （n=9）

由表3可知溶液，其回收率在96.7%～99.2%，平均回收率为98.16%，RSD为0.81%。各个浓度水平的回收率结果均较好，且相对标准偏差较小，由此说明本方法检测结果的准确度高，重复性较好。

3.4 样品检测

按照处方，仿制3批（批号为190701, 190705,190708）乳糖含量已知的氯氮平片样品和参比制剂（批号为T17039）样品，按照上述方法衍生后测定乳糖含量，经过换算得出4个批次乳糖含量及偏差如表4所示。

表4 自制处方和参比制剂中乳糖含量的测定结果Table 4 Determination results of lactose content in homemade prescription and reference preparation

从表4数据可知，本法测定的自制处方中乳糖含量实测值分别为42.09, 43.36, 43.45 mg/片，与处方含量的偏差均小于2.0 mg/片。参比制剂测得乳糖的含量为45.34 mg/片，但其对照含量40.39 mg/片是根据文献[25]报道的，该文献利用的是HPLC结合示差折光检测器检测氯氮平中乳糖的含量。因为检测器的不同、参比制剂的批间差异、方法测定误差等原因，综合导致参比制剂检测结果中乳糖含量检测偏差为4.95 mg/片。本文自制处方的检测结果与实际处方含量相差较小，均小于2.0 mg/片，而文献[25]检测方法中自制检测结果与其实际含量偏差在2.91 mg/片，较本法结果误差偏大。且文献中的检测方法需要使用氨基柱这种特殊类型的色谱柱，其氨基柱的键合官能团氨丙基容易水解，在进行样品检测时，流动相中水的比例较高，易引起氨丙基的水解，从而影响色谱柱的使用寿命。官能团氨丙基带有负电荷，在分析酸性物质（如糖类）时，容易与带质子的酸性物质发生反应，使得氨基柱的柱效降低，影响检测的结果，故需要对氨基柱进行维护。本方法中使用的色谱柱填料为常规的C18填料，分析方法中水相比例可放宽调整，也不会因色谱柱维护不当影响结果检测。因此，利用本实验方法测定的参比制剂数值，可以加快一致性评价项目的处方研究，缩短研发周期和降低研发成本。

4 结论

药物一致性评价要求仿制药与参比制剂在剂型、处方、规格及给药途径等各方面保持一致。仿制药同参比制剂越相似，生物等效性成功的可能性就越大。因此，本研究提出了柱前衍生HPLC-UV法，测定氯氮平片中乳糖含量，即用PMP作为衍生试剂与乳糖衍生后，用HPLC-UV法间接测定氯氮平中乳糖含量。该方法各项参数指标符合中华人民共和国药典的要求，具有经济、简便、专属性强及准确度高等优点，可用于氯氮平片中乳糖的含量测定，进而可推广到其他仿制药中乳糖的逆向研究中。