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雷帕霉素介导丝裂原活化蛋白激酶信号通路对肝癌细胞的影响

2021-09-17倪士峰

解剖学杂志 2021年4期
关键词:雷帕抑制率霉素

巩 江 贺 学 沙 莎 戎 浩 倪士峰

(1 西藏民族大学医学院,咸阳 712082;2 西北大学生科院中药系,西安 710000)

随着肿瘤生物学研究的不断进步,靶向治疗逐渐应用于恶性肿瘤的临床研究中,雷帕霉素(rapamycin,RAPA)属于大黄内酯类药物,易溶于脂肪,能够抑制mTOR信号通路活性,多应用于脏器移植及心脑血管疾病的治疗[1]。目前,大量研究表明,雷帕霉素在胃癌及肺癌临床中具有抗肿瘤作用。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路主要包含3种:JNK(正c-Jun氨基末端转移酶)、P38、细胞外信号调控激酶(ERK)通路,参与多种恶性肿瘤进程。研究表明,细胞因子及细胞外的刺激因子均可调节MAPK信号通路表达,促进肿瘤转移参与血脑屏障的损伤作用[2-3]。凋亡蛋白家族中,Bax可促进凋亡,Bcl-2、Bcl-xl作用与之相反,均参与癌细胞的凋亡及增殖[4]。本研究探讨雷帕霉素介导MAPK信号通路对肝癌细胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞、仪器与试剂

人肝癌细胞BEL-7402细胞(中国科学院上海细胞库);雷帕霉素(Fermanter公司,Israel);Bcl-2、Bcl-xl及Bax抗体(Santa Cruz公司,USA);MAPK抗体(Abcam;USA);流式细胞仪(常州必达科生物)。

1.2 试剂配制

MTT溶液:将MTT粉末溶于PBS缓冲液中制成5 ng/mL的溶液,低温保存。雷帕霉素:将1 mg/mL的雷帕霉素溶于DMSO中,浓度为1 000 mg/mL,低温保存。

1.3 细胞培养

将低温冷藏的BEL-7402 细胞,快速移入37℃水中溶解,离心后,离弃上清液,加入培养基,5%CO2,37.5℃保存,贴壁生长,次日更换培养基,生长到90%时,进行1∶3 传代,继续培养,取对数生长细胞进行实验。

1.4 显微镜下观察BEL-7402 细胞形态

取对数生长细胞,细胞浓度调整为5×103接种至96 孔板中,培养24 h,对照组不加入雷帕霉素干预(对照组),RAPA 处理组加入浓度20 ng/mL(20 ng/mL RAPA 组)、50 ng/mL(50 ng/mL RAPA组)、100 ng/mL(100 ng/mL RAPA 组)雷帕霉素,24 h 后,于显微镜下观察形态并拍照。

1.5 MTT 法检测BEL-7402 细胞增殖

将浓度为1 000 ng/mL 的雷帕霉素溶液采用质量分数为10 的FBS 分别调整浓度为(10、20、50、100)ng/mL,取数目为5×103/mL 接种到96 孔板中,肝癌细胞对照组未加入药物,RAPA 处理组加入以上多个浓度雷帕霉素,培养12、24、48、60 h 及72 h,结束后,在每个孔内加入20 μL MTT,4 h 后,加入150 μL DMSO,摇匀15 min,采用酶标仪于570 nm 波长检测每个孔人BEL-7402 细胞增殖。

1.6 流式细胞仪检测

将BEL-7402 细胞以5×103/mL 数量置于96 孔板,培养1 d 后,在BEL-7402 细胞内加入少量胰蛋白酶,消化4 h 后,用冷藏在-20℃的医用乙醇固定,24 h 后进行离心,弃去上清液,PBS 反复洗涤3 次,每次3~5 min,避光染色,后采用流式细胞仪分析BEL-7402 细胞凋亡程度。

1.7 免疫细胞化学检测组织MAPK 阳性表达

对对照组和RAPA 处理组BEL-7402 细胞进行爬片处理,加入2 ng/mL 多聚甲醛,固定,采用免疫细胞化学显色法检测各组MAPK 阳性表达。

1.8 免疫印迹检测Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白表达

收集对照组及RAPA 处理组BEL-7402 细胞,在96 孔板中加入100 μg 的胰蛋白酶提取液,将细胞提取液放入EP 管中,并与胰蛋白酶提取液按照1∶100 进行混合,再放入冰箱中冷冻10 min。使细胞完全裂变,成为E 溶液;在EP 管中放入BEL-7402 细胞,并按照1∶100 比例加入胰蛋白酶提取液2 mL,使细胞完全裂变,成为F 溶液;再把E和F 溶液以80∶1 的体积进行摇匀,配制成工作液,放入37.5℃的保温箱中20 min,冷却后计算Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白的浓度。

1.9 统计学处理

通过SPSS22.0 软件进行分析BEL-7402 细胞增殖、凋亡,MAPK 阳性表达,Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白相关性,数据用±s表示,行χ2或t检验,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAPA 对BEL-7402 细胞形态学影响

倒置显微镜观察,对照组细胞呈梭形生长,细胞质、细胞核正常。RAPA 处理组BEL-7402 细胞生长明显受到抑制,20 ng/mL RAPA 组BEL-7402细胞壁逐渐脱落,悬浮于培养液中,50 ng/mL RAPA 组 BEL-7402 细胞呈现透明度及黏附力逐渐降低,形态呈现不规则改变,细胞数目减少,100 ng/mL RAPA 组BEL-7402 细胞形成分裂小体,固缩凋亡(图1)。

图1 RAPA 对BEL-7402 细胞形态学影响,×200

2.2 雷帕霉素对BEL-7402 细胞增殖抑制率的影响

对照组BEL-7402 细胞增殖抑制率最低,RAPA 处理组BEL-7402 细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05);随着时间延长及雷帕霉素浓度的升高,细胞生长抑制率逐渐升高,RAPA 干预处理100 ng/mL RAPA 组在24、48 h 及72 h 的BEL-7402细胞生长抑制率高于20 ng/mL、50 ng/mL RAPA组(P<0.05)(图2)。

图2 雷帕霉素对BEL-7402 细胞增殖抑制率的影响

2.3 雷帕霉素对BEL-7402 细胞凋亡率的影响

对照组细胞的凋亡率为7.17%,20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL RAPA 组细胞的凋亡率分别为18.89%、25.77%、38.56%。RAPA 处理组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),100 ng/mL RAPA 组凋亡率高于20 ng/mL 、50 ng/mL RAPA 组,差异有统计学意义(P<0.05),说明随着浓度的升高,BEL-7402 细胞凋亡率升高(图3)。

图3 雷帕霉素对BEL-7402 细胞凋亡率的影响

2.4 RAPA 对BEL-7402 细胞中MAPK 阳性表达率的影响

对照组BEL-7402 细胞中MAPK 阳性表达率高于RAPA 处理组(P<0.05),随着雷帕霉素浓度的升高,RAPA 处理组MAPK 阳性表达率不断降低,100 ng/mL RAPA 组中MAPK 阳性表达率低 于 组50 ng/mL RAPA 组(P<0.05),50 ng/mL RAPA 组MAPK 阳性表达率低于20 ng/mL RAPA 组(P<0.05)(图4)。

图4 BEL-7402 细胞MAPK 阳性表达率

2.5 雷帕霉素对BEL-7402 细胞中Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影响

对照组BEL-7402 细胞中Bcl-2、Bcl-xl 蛋白升高,与RAPA 处理组比较差异有统计学意义(P<0.05),RAPA 处理组Bcl-2、Bcl-xl 蛋白水平随着雷帕霉素的浓度升高而降低,两两比较存在差异(P<0.05),20 ng/mL RAPA 组 BEL-7402 细胞中Bcl-2、Bcl-xl水平高于50 ng/mL RAPA组(P<0.05),50 ng/mL RAPA 组 Bcl-2、Bcl-xl 表达水平高于100 ng/mL RAPA 组(P<0.05),Bax 水平与Bcl-2、Bcl-xl 相反(图5,表2)。

表2 RAPA 对各组细胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影响(n=5,±s)

表2 RAPA 对各组细胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影响(n=5,±s)

*P<0.05 vs 对照组;△P<0.05 vs 20 ng/mL RAPA 组;#P<0.05 vs 50ng/mL RAPA 组

组别BaxBCL-2Bcl-xl对照组0.014±0.0020.026±0.0040.031±0.005 20 ng/mL RAPA 组0.021±0.003*0.022±0.002*0.026±0.003*50 ng/mL RAPA 组0.024±0.005*△0.021±0.001*△0.023±0.002*△100 ng/mL RAPA 组0.029±0.006*△#0.015±0.001*△#0.017±0.001*△#

图5 各组细胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 表达水平

3 讨论

雷帕霉素最初被作为抗真菌药物,后逐渐应用于器官移植实验中,雷帕霉素对肺癌、肾癌等具有抗癌细胞扩散及增殖作用[5]。动物实验表明,RAPA 辅助用药或联合其他药物能够减少癌细胞的远处转移,主要是通过抑制血管生长因子的分化来遏制肿瘤细胞的生成和发展,对治疗恶性肿瘤患者的器官移植具有重要作用[6-7]。

肝癌细胞的发生与发展是一个复杂且多环节的过程,临床中对肝癌细胞的遏制方法主要包含减少肝癌细胞活性、抑制其增殖和迁移,诱导细胞凋亡[8]。本研究中,雷帕霉素处理组的BEL-7402细胞增殖抑制率、凋亡率随着雷帕霉素浓度升高和时间增加,细胞形态逐渐改变,癌细胞崩解坏死。雷帕霉素对肝癌细胞的抑制机制主要通过两个方面,一种是对肝癌细胞mTOR进行灭活,mTOR对肝癌细胞具有调节生物学行为的作用,并通过其他因子诱导癌细胞进行远处侵袭[9-10]。雷帕霉素具有抗肿瘤突变作用,对mTOR磷酸化的肝癌细胞药物敏感性较强,减少mTOR介导的信号转导,遏制肝癌细胞增殖,加快凋亡。另一种是减少肝癌细胞中血管生长因子表达,并已经成为研究的热点[11-12]。钱妍至等[13]研究表明,雷帕霉素对肝癌细胞具有抑制作用,具有时间剂量性,能够加快癌细胞进入凋亡期,提高细胞凋亡率,这与赵嵌嵌等[14]研究结果相似。

MAPK家族具有连接肝癌细胞受体与DNA表达之间信号调节的作用,具有促进分化及生长存活作用。其下经典的通路包含多种,在肝癌细胞中MAPK与mTOR能够相互作用,共同促进肝癌细胞激活[15]。雷帕霉素属于mTOR抑制剂,会减少MAPK与mTOR之间的激活,减少其表达。本研究中,雷帕霉素处理组BEL-7402细胞中的MAPK阳性表达率低于对照组,并随着雷帕霉素浓度的升高而减少。与毛良浩等[16]报道雷帕霉素能够抑制MAPK磷酸化,并具有较强的浓度依赖性的研究结果相似。

Bcl-2家族在多种恶性肿瘤细胞的凋亡中发挥作用,下游因子分为不同亚型,Bcl-2、Bcl-xl能够减少肝癌细胞坏死,Bax作用与之相反,具有促进肝癌细胞坏死作用,减少肝癌肿瘤坏死,延长存活期[17-18]。本研究结果显示,雷帕霉素能够抑制Bcl-2、Bcl-xl的表达,提高Bax水平,这与雷帕霉素能够加快线粒体体膜电位丢失,促进肝癌细胞凋亡有关。

综上所述,雷帕霉素能够抑制肝癌细胞增殖,加快坏死及破裂,随着雷帕霉素浓度升高,凋亡程度增大,其作用机制可能与抑制MAPK、Bcl-2、Bcl-xl 表达,促进Bax 水平升高有关。

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