MiR-494通过核转录因子-κB通路对脓毒症大鼠肾损伤的作用机制*

卢 鹏 张 雷 樊晶晶 李 菁 朱一堂

（沧州市中心医院，1 检验科，2 急诊医学部，3 眼功能科，沧州 061001）

脓毒症是临床常见的由感染引起的全身炎症反应综合征，表现为全身炎症反应，常见有尿道感染、脑部感染等[1]。脓毒症通常发生有手术史或者是烧伤患者，约50%脓毒症患者出现肾损伤[2-3]。有研究显示，脓毒症的发病率很高，在重症监护患者中其发病率约为30%，且还在逐年增长[4]。微小RNA（microRNA，miR）是一类内源性小分子非编码RNA，在转录后调控基因的表达。miR-494 是miR 家族中的一员，可能是调控细胞的生长、转移的重要因子[5]。核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）为一种蛋白因子，与细胞凋亡和基因转录调控有关，能够调控炎症因子、趋化因子及凋亡相关基因[6]。NF-κB 通路参与脓毒症大鼠肾上皮细胞的凋亡和炎症反应的过程[7]。因此，本研究旨在探讨miR-494 通过NF-κB通路对脓毒症大鼠肾损伤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

45 只健康雄性SD 大鼠购自辽宁动物实验中心，体质量270～330 g。常温下饲养，让大鼠适应7 d 新的环境。将45 只大鼠随机分为脓毒症大鼠模型组（模型组），注射miR-494 inhibitor 脓毒症大鼠模型组（miR-494 inhibitor 组）、假手术组（sham组），每组15 只。

1.2 模型建立与标本采集

3 组大鼠均经10%苯巴比妥钠麻醉后开腹，模型组和miR-494 inhibitor 组大鼠常规脱毛、消毒后，逐层分离皮肤，分离右肾蒂及输尿管，采用1 号丝线，结扎肾蒂和右输尿管，继续分离左肾，采用无创伤性夹钳闭合肾动脉35 min，后逐层关闭腹腔，建模过程中1 只大鼠死亡，假手术组动物打开腹腔，并进行左、右两肾分离肾包膜后即可。miR-494 inhibitor 组在造模成功后大鼠尾部注射miR-494 inhibitor 5 μL，连续注射3 d。第4 天处死3 组大鼠，分离肾。采用甲醛固定60 min，常规脱水、浸蜡、制片，厚度为3～4 μm。

1.3 RT-PCR 检测大鼠肾组织中miR-494 的表达

分别将3 组大鼠的肾组织取出，用TRIzol 裂解研磨后的组织，提取总的RNA，逆转录按照说明书严格进行，将逆转后所得的cDNA 进行荧光反应实验。miR-494 上游引物序列为5'-ACACTCCA GCTGGGAGGTTGTCCGTGTT-3'，下游引物序列为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3'；GAPDH 上游引物序列为5'-CATGAGAAGTATG ACAACAGCCT-3'，下游引物序列为5'-AGTCCT TCCACGATACCAAAG T-3'。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环。由仪器自带软件获取Ct 值，按公式2－△△Ct计算miR-494 表达量。

1.4 全自动生化分析仪测定大鼠血清生物化学指标

建立脓毒症模型24 h 后，分别取3 组大鼠静脉血2 mL，检测血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，在笼内收集大鼠尿液，收取上清液，测量24 h 尿蛋白定量（UTP）的含量。

1.5 ELISA 法检测大鼠血清炎症因子水平

将3 组大鼠静脉血进行常规方法取血清，采用ELISA 法检测3 组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）水平，取平均值。

1.6 Masson三色法分析大鼠肾组织病理结构

取3 组大鼠肾组织切片，8%甲醛在低温下进行48 h 处理，无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡切片2 μm。脱石蜡后清水清洗，采用Masson 三色法试剂盒（上海信帆生物科技有限公司）染色，无水乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封固。显微镜下观察肾组织病理变化[8]。

1.7 TUNEL 检测肾小管细胞凋亡

取3 组大鼠肾组织浸蜡包埋制做石蜡切片，厚度为2 μm。采用TUNEL 将切片进行染色，每张切片选择不重复的5 个方位用显微镜（×400）进行观察，计数肾小管凋亡细胞数目和细胞总数[9]。肾小管细胞凋亡=凋亡细胞/总细胞×100%。

1.8 免疫印迹检测肾组织NF-κB 蛋白含量

取3 组大鼠的50 mg 肾组织，细胞裂解后提取核蛋白，对核蛋白的浓度进行定量，分装后，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液按照4∶1 的比例进行混匀，煮沸使蛋白质变性。电泳板孔内注入蛋白样品50 μg。转移至PVDF 膜上后加脱脂奶粉，封闭1 h 后再在30 min 内漂洗3次，最后加入兔抗鼠NF-κB 抗体（1∶1 000，厦门慧嘉生物科技有限公司）1 h。取出PVDF 膜后再漂洗3 次，每次10 min，用博士德生产的DAB 试剂盒及ECL 化学发光试剂盒进行显影、定影，计算目的条带与GAPDH 比值，求得NF-κB 蛋白的相对表达含量。

1.9 统计学处理

采用SPSS22.0 软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间两两比较采用t检验，3 组间比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织中miR-494 的表达

与假手术组相比，模型组及miR-494 inhibitor组大鼠肾组织中miR-494 表达量均升高（P<0.05），但miR-494 inhibitor 组大鼠miR-494 表达低于模型组（P<0.05）（图1）。

图1 3 组大鼠肾组织中miR-494 的表达情况

2.2 血清炎症因子表达

假手术组大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β的表达最低，模型组大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β的表达最高。与模型组相比较，miR-494 inhibitor组大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β的表达显著降低。与假手术组相比，miR-494 inhibitor组的表达显著升高（P<0.05）（表1）。

表1 3 组大鼠炎性因子表达情况（n=15，±s，mg/L）

表1 3 组大鼠炎性因子表达情况（n=15，±s，mg/L）

*P<0.05 vs 假手术组；#P<0.05 vs 模型组

组别IL-6TNF-αIL-1β假手术组 7.29±1.210.21±0.120.90±0.25模型组13.05±2.68*0.46±0.17*4.46±0.21*miR-494 inhibitor 组 8.76±1.47*# 0.31±0.14*#2.93±0.23*#

2.3 肾组织病理比较

假手术组肾组织结构完整，肾小管等状况良好。MiR-494 inhibitor 组肾小球间质增多，肾间质增宽，炎症细胞浸润严重。模型组与miR-494 inhibitor 组相比，肾小球硬度增加，肾小管周围组织炎症浸润更加严重（图2）。

图2 大鼠肾组织病理结构比较，标尺=20 μm。A：假手术组；B：模型组；C：miR-494 inhibitor 组.

2.4 生物化学指标比较

与假手术组相比，模型组和miR-494 inhibitor组大鼠血清中Scr、BUN 和UTP 的水平均明显升高（均P<0.05）；与模型组相比，miR-494 inhibitor 组大鼠血清中Scr、BUN 和UTP 的水平降低（P<0.05）（表2）。

表2 3 组大鼠生物化学指标比较（n=15，±s）

表2 3 组大鼠生物化学指标比较（n=15，±s）

*P<0.05 vs 假手术组；#P<0.05 vs 模型组

组别Scr（nmol /L）BUN（mmol/L）UTP（mg）假手术组31.59±3.653.67±1.731.07±0.24模型组48.64±2.52*12.17±2.14*2.15±0.34*miR-494 inhibitor 组40.05±2.68*#7.15±2.10*#1.66±0.28*#

2.5 miR-494 对肾小管上皮细胞凋亡的影响

棕黑色细胞为凋亡细胞。与假手术组相比，模型组大鼠肾小管上皮细胞的凋亡数目显著增多（P<0.05），miR-494 inhibitor 组中大鼠肾小管上皮细胞的凋亡数目少于模型组（P<0.05）（图3、4）。

图3 大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况，标尺= 50 μm。A：假手术组；B：模型组；C：miR-494 inhibitor 组.

2.6 肾组织中NF-κB p65 蛋白表达

模型组NF-κB p65 蛋白含量最高，miR-494 inhibitor 组中大鼠NF-κB p65 的蛋白含量比假手术组的蛋白含量高（P<0.05），但较模型组NF-κB 明显降低（P<0.05）（图5）。

图5 大鼠肾组织中NF-κB p65 蛋白表达

3 讨论

脓毒症是细菌在血液中繁殖，释放毒素所引起，致死率高[10]。其中，大手术、烧伤、感染等是临床中并发脓毒症的较常见原因[11]。脓毒症可能会累及机体多个器官功能受到损害，死亡率可达30%左右[12]。本研究结果显示，假手术组大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量最低，脓毒症组大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量最高，miR-494 inhibitor 组大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量较脓毒组有所降低。病理组织观察到假手术组肾组织结构完整，miR-494 inhibitor 组肾小球间质增多，炎症细胞浸润严重；模型组与miR-494 inhibitor 组相比，肾小球硬度增加，肾小管周围组织炎症细胞浸润更加严重。研究表明miR-494 是一种可以影响细胞活性的miR，它可根据细胞所处的环境和作用靶点的变化，既可发挥促凋亡作用，又可发挥抗凋亡的作用，同时还可以调控炎症因子[13]。研究显示，miR-494 可以通过多种途径参与肾缺血再灌注损伤炎症反应的调控。小鼠肾小管上皮细胞在经过脂多糖刺激后，小鼠体内miR-494 的表达出现异常，多种炎症相关因子表达变化，表明miR-494 参与肾损伤的炎症反应[13]。动物实验得出，miR-494 过表达会增加大鼠肾组织及细胞的损伤，从而影响肾功能[15]。同时，miR-494 能提高脓毒症大鼠的炎症因子水平，损伤肾功能，显微镜观察肾组织病理形态的变化也证明了这一观点[16]。

图4 大鼠肾小管上皮细胞凋亡率

本研究结果显示，模型组大鼠Scr、BUN 和UTP 水平升高，而miR-494 inhibitor 组上述指标有所降低，但仍然比假手术组高。Scr 与肾小球过滤功能具有关联，Scr 处于非稳定期，意味着肾功能发生改变[17]。有研究指出Scr、BUN 和UTP 水平升高提示肾存在缺血现象，是评价肾损伤患者的敏感指标[18]。

本研究通过病理、肾小管细胞凋亡程度和肾组织中NF-κB 蛋白表达情况表明，miR-494 inhibitor组大鼠中肾小管上皮细胞的凋亡数目比模型组少，比假手术组多；miR-494 inhibitor 组大鼠的NF-κB蛋白表达比模型组低，但比假手术组的NF-κB 蛋白表达高。结果提示miR-494 能够通过提高NF-κB 的表达来促进炎症因子的释放，进而促进肾小管细胞凋亡，加重脓毒症患者病情。尽管miR-494 对脓毒症大鼠的作用机制目前尚不明确，但许多学者认为NF-κB 通路在此过程成中发挥重要作用。NF-κB 是一种纤维细胞产生的促炎症因子，参与调节免疫及炎症反应，也是一种调节细胞凋亡因子，在调节肾上皮细胞凋亡方面发挥重要作用。miR-494 是一种能够参与免疫反应的调控因子，它可以活化组织中的STAT3 和NF-κB 等信号通路，促进NF-κB 的表达，进而促进炎症因子的释放。近些年，关于miR参与肾病理改变的研究越来越多，在一项关于对肾损伤大鼠肾组织的miR 筛查过程中，miR-494 表达升高，这说明miR-494 与肾损伤存在关联性[19]。细胞及动物实验研究表明，在脓毒症模型中miR-494 表达升高会加重模型大鼠肾小管上皮细胞凋亡，对大鼠皮下注射miR-494 抑制剂后，肾损伤有所缓解[20]。有文献报道脓毒症大鼠肾组织高表达miR-494，是健康大鼠肾组织中的2～3 倍以上，随着miR-494 升高，脓毒症大鼠中炎症因子水平逐渐升高，病情恶化[21-22]。

综上所述，miR-494 可能通过提高NF-κB 的表达，促进脓毒症大鼠炎症因子的释放，进而加重大鼠的肾损伤程度。