粉防己碱通过JAK2-STAT3途径减轻心肌缺血/再灌注损伤*

张文超 方秧青 钟静红 张 明

（1 余姚市人民医院麻醉科，余姚 315400，2 宁波市鄞州区第二医院药剂科，宁波 315000）

缺血性心脏病是死亡的主要原因之一，尽早恢复缺血区域的血液灌注是治疗缺血性心脏病患者的有效方法，然而血流的恢复可能会导致组织损伤，称为心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤[1-2]。粉防己碱（tetrandrine，Tet）是一种双苄基四氢异喹啉生物碱，已被证明对多种心血管疾病有益，例如高血压、心律不齐、心绞痛、门脉高压症等[3]。粉防己碱还可以保护动物免受缺血再灌注引起的心肌损伤，但其机制仍不清楚。Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）-信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路参与了包括细胞生长、分化、增殖、凋亡和炎症等多个生理过程[4]。先前的研究表明，JAK2-STAT3 对于缺血后心脏保护至关重要，缺血后JAK2-STAT3 的激活增加了线粒体中磷酸化STAT3 的表达，从而改善了线粒体功能，并最终减轻了心肌I/R 损伤[5]。但是，JAK2-STAT3 信号通路是否在粉防己碱给药后的心脏保护中起作用尚不明确，故对其进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

32 只成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠（体质量250～300 g）由杭州子源实验动物科技有限公司（生产许可（浙）2019-0004）提供。大鼠在22℃±2℃的自然光（12 h）和黑暗（12 h）循环标准条件下，喂食普通的实验室食物，并在实验期间自由饮水。

兔抗JAK2 单克隆抗体，兔抗p-JAK2 单克隆抗体，兔抗STAT3 单克隆抗体，兔抗p-STAT3 单克隆抗体，Bax、Bcl-2、GAPDH 抗体和辣根过氧化物酶购自Cell Signaling Technology；JAK2 抑制剂AG490 购自Sigma-Aldrich；戊巴比妥购自上海泰瑞生物技术有限公司。

1.2 模型建立及动物分组

将32 只大鼠随机分为4 组，每组8 只。①假手术组（Sham 组）；②缺血再灌注组（I/R 组），腹腔注入生理盐水1.2 mL 预处理后行I/R；③粉防己碱组，在进行I/R 前1 h 腹腔内注射3 mg/kg（约1.2 mL）粉防己碱，余同I/R 组；④粉防己碱+ AG490组（Tet+AG490 组），在进行I/R 前1 h 腹腔内注射粉防己碱和AG490，余同粉防己碱组。大鼠心肌I/R 模型的建立采用结扎冠状动脉左前降支法制备[6]，用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg 腹腔内）麻醉大鼠，并使用小动物呼吸机（HX-101E）以体积控制模式每分钟80 次进行人工通气。然后，从左胸骨边界沿第5 个肋间隙通过左胸廓切开术暴露左腋窝，使用6-0 手术缝合线将左前降支冠状动脉（LAD）结扎至距其起点约2 mm，通过观察缝合线下方左心室的浅心肌层确认闭塞，心肌缺血30 min，然后再灌注4 h。假手术组中缝合线在LAD 下通过，但没有闭塞。

1.3 血液动力学监测

使用Powerlab/8SP 数据采集分析系统收集再灌注结束时的心率（heart rate，HR）、左心室舒张压（left ventricular developed pressure，LVDP）、左心室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）和左心室内压最大上升速率（maximum rate of rise and fall of left ventricular pressure，+dp/dtmax）。

1.4 氯化三苯基四氮唑（TTC）测量心肌梗死面积

再灌注结束时，将心立即置于-80℃的冰箱中，然后沿心矢状切面切成2～3 mm 厚的切片，置于TTC 溶液（37℃，1%TTC，pH 7.4）中25 min，然后放入10%甲醛溶液中固定过夜。用数码相机拍摄图像后，使用Image J 软件分析梗死区域。

1.5 乳酸脱氢酶（LDH）含量的测定

通过测量冠状动脉流出液中的LDH 浓度评估心损伤程度。按照制造商的说明，使用日立全自动生化分析仪测定冠状动脉流出液的LDH 水平。

1.6 心肌三磷酸腺苷（ATP）含量测定

称取心肌组织1 g，3000 r/min 离心5 min，取上清液，按照ATP ELISA 检测试剂盒操作说明书进行测定。

1.7 线粒体活性氧（ROS）生成的测定

差速离心法提取线粒体，荧光标记2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测量线粒体ROS 生成速率。

1.8 免疫印迹检测心肌p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白水平

用于SDS-PAGE 的含有30 μg 蛋白质的样品（Invitrogen 公司）裂解，密封并转移至膜上。将其与p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Bcl-2、Bax 和GAPDH 一抗（4 ℃，1∶1 000）孵育过夜。然后用TBST 溶液清洗膜。最后，将其与室温下带有HRP 标记的二抗（1∶1 000）孵育1 h。用Quantity One 2.6.2 图像分析系统分析扫描图像，以目的基因条带与内参条带的灰度值比作为蛋白相对表达量。

1.9 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料用±s表示。通过单因素方差分析ANOVA 和Tukey 事后多重检验（组间两两比较）进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心功能指标比较

假手术组心肌的LVDP、+dp/dtmax和LVEDP显著高于I/R组，差异有统计学意义（P<0.05，表1）。与I/R组相比，粉防己碱组LVDP和+dp/dtmax显著增加，而LVEDP显著降低（P<0.05）。与粉防己碱组相比，粉防己碱+AG490组LVDP和+dp/dtmax显著降低，而LVEDP显著升高（P<0.05，表1）。

表1 心功能指标的变化情况（±s）

表1 心功能指标的变化情况（±s）

*P<0.05 vs 假手术组；#P<0.05 vs I/R 组；△P<0.05 vs 粉防己碱组

组别心率（bpm）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）+ dp/dt（mmHg/s）假手术组258.97±8.9771.36±5.868.25±2.052 667.05±225.00 I/R 组250.69±9.0846.51±6.29*16.67±1.95*1 636.26±297.95*粉防己碱组259.53±8.2958.37±7.17*#11.55±1.94*#2 291.96±211.52*#粉防己碱 +AG490 组249.92±10.8348.57±5.78*△16.75±1.66*△1 656.82±289.66*△

2.2 心肌梗死面积和LDH 释放比较

假手术组的心肌梗死面积和LDH水平显著低于I/R组，差异有统计学意义（P<0.001，图1）。与I/R组相比，粉防己碱组心肌梗死面积和LDH水平显著减少（P<0.001）。与粉防己碱组相比，粉防己碱+AG490组心肌梗死面积和LDH水平显著增加（P<0.05，图1）。

图1 粉防己碱给药后减少心肌梗死面积和LDH 释放

2.3 粉防己碱可增加I /R 后心肌中p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2 的水平，并降低Bax 的水平

与I/R 组相比，粉防己碱组p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2 蛋白表达显著升高（P<0.001），Bax 蛋白表达显著降低（P<0.001）（图2）。与粉防己碱组相比，粉防己碱+AG490 组p-JAK2、p-STAT3 和Bax蛋白表达显著降低（P<0.001），Bax 蛋白表达显著上升（P<0.001，图2）。

图2 大鼠p-JAK2（B）、p-STAT3（C）、Bcl-2（D）和Bax（E）的表达定性（A）和定量（B～E）变化

2.4 粉防己碱改善心肌能量代谢

与假手术组相比，I/R 组心肌ATP 含量显著降低（2.96±0.29 比7.87±0.35）。与I/R 组相比，粉防己碱组ATP 含量显著升高（5.71±0.30 比2.96±0.29）（P<0.01），而粉防己碱+AG490 组和I/R 组之间ATP 含量差异无统计学意义（P>0.05）。

2.5 线粒体ROS 产生率

与假手术组相比，I/R 组线粒体ROS 产生率显著增加（13.13±1.58 比7.20±1.51），与I/R 组相比，粉防己碱组线粒体ROS 的产生率显著降低（9.37±1.23 比13.13±1.58）（P<0.01）。与粉防己碱组相比，粉防己碱+AG490 组线粒体ROS 产生率显著增加（13.11±0.29 比9.37±1.23）（P<0.01）。

3 讨论

粉防己碱是一种天然的双苄基异喹啉生物碱化合物，具有显著的生物利用度，并具有抗癌作用、抗炎和细胞保护作用，已用于治疗心血管疾病和高血压。研究证实，粉防己碱可提供良好的心肌保护，是一种有前途的心肌损伤治疗方法[3]。本研究中粉防己碱能显著改善心功能指标，减少心肌梗死面积，研究结果证实粉防己碱可能起到良好的心保护作用。

据报道，活性氧涉及许多疾病，包括神经系统疾病、心力衰竭和高血压等[8]，其在心肌保护中起着双重作用。在I /R 的早期阶段，低水平的ROS可以激活多种保护性信号通路，而高水平的ROS可以引起心肌细胞的氧化应激损伤。因此，有必要将线粒体ROS 的产生降至最低，以防止心肌细胞I/R 损伤[8]。本研究评估了粉防己碱对线粒体ROS的产生速率的影响，结果提示粉防己碱的心肌保护作用与抑制线粒体ROS 产生有关。

另外，线粒体是心肌I/R 期间ROS 的主要来源，有研究表明Bcl-2 表达的下调可能诱导ROS 的产生[7]。本研究结果显示粉防己碱上调Bcl-2 蛋白水平，并抑制Bax 蛋白水平。有研究显示，粉防己碱治疗可降低线粒体ROS 的产生并抑制促凋亡因子Bax 蛋白表达，从而抑制细胞凋亡[3]。再灌注期间会产生大量的ROS，导致心肌Ca2+超负荷，从而损害线粒体功能，诱导炎症递质的产生，并最终导致心肌细胞凋亡增加，特别是再灌注开始后几分钟内大量释放的ROS 被认为是导致心肌缺血再灌注损伤的主要诱因[9]。因此，推测粉防己碱可以通过降低ROS，从而抑制心肌细胞凋亡。

心肌细胞凋亡是心肌I/R 损伤的重要因素[7]，先前研究表明，激活的JAK2 和STAT3 可保护心肌细胞免于凋亡[7，10]。Zhang 等[11]报道粉防己碱可抑制心脏细胞模型中I/R 诱导的损伤，并与JAK3/STAT3/HK Ⅱ信号通路有关。JAK2-STAT3 信号通路是器官保护的重要组成部分，涉及心、大脑、肾和肝等许多器官[7，12-13]。JAK 家族由JAK1、JAK2、JAK3 和Tyk2 4 个成员组成，STAT 的磷酸化主要受JAK1、JAK2 和JAK3 调控[13]。本研究结果显示粉防己碱显著增加p-JAK2 和p-STAT3 表达，JAK2 选择性抑制剂AG490 逆转了粉防己碱对细胞凋亡和JAK2-STAT3 途径的心保护作用。证实了粉防己碱激活了JAK2-STAT3 信号转导途径，上调了Bcl-2蛋白水平，并下调了Bax 蛋白水平，最终抑制了心肌细胞凋亡，并减小了心肌梗死面积。

综上所述，粉防己碱的心保护作用与JAK2-STAT3 的激活有关，粉防己碱给药后p-JAK2 和p-STAT3 的表达增加，这可能使得线粒体ROS 生成减少和线粒体ATP 含量增加，从而减少了细胞凋亡和心肌梗死面积。