血清转化生长因子β1、单核细胞趋化蛋白-1、低氧诱导因子-1α水平与慢性肾衰竭患者肠道菌群的相关性

陈豫闽 刘俊英 贾国强 郭志玲

慢性肾衰竭(CRF)是所有慢性肾病的终末结局，但其致病机制尚不清楚，血清转化生长因子β1(TGF-β1)是最常见的致肾纤维化生长因子[1]，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)参与免疫及炎症反应[2]，低氧诱导因子(HIF)-1α高表达会促进纤维化因子表达[3]。有研究显示，以上因子均与肾组织病变及肾脏疾病发展间存在密切联系，其血清浓度在反映肾衰竭病情中具有一定价值。而饮食改变、长期服药、肠道pH改变、肠道内蛋白质分解细菌数量增多等多种因素将造成CRF患者肠道菌群失衡[4]。本文主要研究血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平与CRF患者肠道菌群间的关系，探讨肠道菌群失衡在CRF中的作用。

对象与方法

1.对象：纳入2015年1月～2019年1月我院收治的111例CRF患者为CRF组，其中男61例，女50例，年龄22～65岁，平均年龄(44.89±16.58)岁，原发疾病分布：慢性肾小球肾炎63例，慢性间质性肾炎33例，糖尿病肾病15例。纳入标准：(1)符合《内科学》(第六版)中CRF的诊断标准；(2)血清肌酐(SCr)高于正常上限值，心力衰竭、感染得到控制；(3)未使用糖皮质激素或免疫抑制剂，且尚未进行透析治疗，估算的肾小球率过滤(eGFR)<50 ml·min-1·(1.73 m2)-1。排除标准：(1)合并心血管疾病、内分泌疾病、肝脏、肺脏、造血系统等严重原发疾病；(2)合并消化系统疾病；(3)合并恶性肿瘤、移植肾、孤立肾；(4)参与研究前6个月有手术史；(5)近期使用抗生素或益生菌等影响肠道菌群药物。将同期于我院体检的健康者50例作为对照组，其中男28例，女22例，年龄23～66岁，平均年龄(46.71±15.22)岁，两组受试者性别及年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)一般资料和临床资料收集：收集患者的一般资料(性别、年龄、原发疾病)及实验室检查指标[血尿氮素(BUN)、SCr、血红蛋白(Hb)]，采用EPI公式[5]计算eGFR。

(2)血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平检测：采用生物素-亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA)检测血清TGF-β1水平，TGF-β1试剂盒由上海森雄科技实业公司提供。采用ELISA检测血清MCP-1及HIF-1α水平，MCP-1 ELISA试剂盒购自上海源叶锐谷生物科技有限公司，HIF-1α ELISA试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司。

(3)粪便采集及菌群分析：使用无菌采样盒收集受试者粪便标本，密封好后置入-80 ℃冰箱保存，使用德国Invitek Biotechonlogy and Biodesign公司生产的DNA提取检测试剂盒进行16S rRNA测序分析与菌群鉴定。菌群分析方法：使用16S rRNA V4～V6区引物进行PCR扩增，引物为V4F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)及V6R(5’-ACAGCCATGCNCACCT-3’)，共进行25个循环，使用HiSeq第二代高通量测序平台对PCR产物行双端测序，测序完成后，使用Silva数据库对样本进行物种对比与注释，使用BugBase进行表型预测。采用线性判别分析(LDA)分析菌种的差异。

结 果

1.两组受试者实验室检查指标比较：CRF组患者BUN及SCr水平与对照组相比均显著上升，eGFR及Hb水平均显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 两组受试者实验室检查指标比较

2.两组受试者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平比较：CRF组患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平与对照组相比均显著上升(P<0.05)。见表2。

表2 两组受试者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平比较

3.CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α与实验室指标的相关性分析：Pearson相关分析结果显示，CRF患者血清TGF-β1与SCr呈正相关，与eGFR呈负相关(P<0.05)；血清MCP-1与BUN、SCr均呈正相关，与eGFR呈负相关(P<0.05)；血清HIF-1α与BUN、SCr均呈正相关，与eGFR及Hb均呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α与实验室指标的相关性分析

4.两组受试者肠道菌群LDA值分布特征：两组受试者肠道菌落差异分析见图1。其中根据LDA分值可以看出，对照组中疣微菌科、柔嫩梭菌属、双歧杆菌与乳酸杆菌相对丰度高于CRF组，而CRF组中毛螺菌科、克雷伯菌属、大肠埃希菌属与肠杆菌科相对丰度高于对照组。

图1 两组受试者肠道菌群LDA值分布特征

5.CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α与不同菌群水平的相关性分析：Pearson相关分析结果显示，CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α与毛螺菌科、大肠埃希菌属及肠杆菌科水平均呈正相关，血清TGF-β1与克雷伯菌属水平呈正相关，血清TGF-β1、MCP-1与疣微菌科水平均呈负相关，血清TGF-β1与双歧杆菌及乳酸杆菌水平均呈负相关，血清HIF-1α与双歧杆菌水平呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α与不同菌群水平的相关性分析

讨 论

健康人的消化道内定居了约100万亿微生物，其共同构成了复杂而庞大的微生态系统。正常情况下，肠道菌群维持动态平衡，参与人体消化吸收、能量代谢、免疫反应等生理活动，与人体相互适应[6]。CRF是各种慢性肾脏病的终末结局，CRF患者肾脏出现肾小管萎缩、肾小球硬化、肾间质纤维化等病理改变，该病同时损害肠道屏障，导致肠道微生态失衡。

CRF导致肠道微生态失衡的具体机制尚未明确，但可能与CRF患者结肠排空时间延长、肠道蠕动减慢、消化能力下降、肠道内可利用蛋白增多、患者血液尿素水平上升后其水解产生的氮水平增多导致肠腔粪便pH值改变、药物使用等原因相关[7-8]。本文将111例CRF患者及50例健康者作为研究对象，分析两组受试者肠道菌群特征，结果发现，CRF患者肠道菌群发生了改变，对照组疣微菌科、柔嫩梭菌属、双歧杆菌及乳酸杆菌相对丰度高于CRF组，而CRF组患者毛螺菌科、克雷伯菌属、大肠埃希菌属及肠杆菌科相对丰度高于对照组，提示CRF患者肠道微生态失衡。肠道微生态失衡将产生多种不良影响，肠道菌群失调可引起菌群移位、毒素增多及局部及全身炎症反应，加速肾功能恶化进展，增加患者不良预后风险，其具体致病机制尚未清楚[9-10]。

相关研究表明，多种细胞因子均参与CRF患者肾脏病理改变，其中TGF-β1是公认的致肾纤维化的重要生长因子，TGF-β1的过度堆积将导致肾组织细胞外基质过度沉积，促进肾组织纤维化[11-12]。肾组织病理改变还与炎症反应密切相关。MCP-1是一种对单核细胞具有趋化和激活活性的细胞因子，可特异性趋化单核细胞到组织，同时参与炎症反应、免疫调节，在MCP-1作用下，单核细胞与淋巴细胞聚集在内膜下发生一系列免疫及炎症反应，正常状况下，血清MCP-1水平较低[13]。肾小球硬化与毛细血管疏松是肾小管缺氧的常见原因，与此同时，肾小管缺氧也将引起间质瘢痕的形成，导致肾小管萎缩，加速肾脏病变[14]。有研究结果表示，当缺氧时，HIF-1α在肾脏上皮细胞上呈高表达，进而增加促纤维化因子的表达，加速肾纤维化[15]。本研究结果发现，与对照组比较，CRF组患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平均显著上升，且血清TGF-β1与SCr水平呈正相关，与eGFR呈负相关，血清MCP-1与BUN、SCr水平均呈正相关，与eGFR呈负相关，血清HIF-1α与BUN、SCr水平呈正相关，与eGFR及Hb水平呈负相关。提示肠道微生态失衡可能加重肾组织纤维化及炎症反应，参与CRF的发病机制。

分析CRF患者肠道菌群与血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平的关系发现，毛螺菌科、大肠癌细菌属及肠杆菌科与CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平均呈正相关，血清TGF-β1水平与克雷伯菌属呈正相关，血清TGF-β1、MCP-1水平与疣微菌科均呈负相关，血清TGF-β1水平与双歧杆菌及乳酸杆菌均呈负相关。CRF患者胃肠蠕动能力下降，消化能力减弱，消化道内尿素水平上升，以上变化将引起具有酚类、脲酶形成酶的细菌家族得到扩展，进一步加重患者肠道菌群失衡及炎症反应。同时，克雷伯菌属、大肠埃希菌属还可通过将磷脂酰胆碱与左旋肉碱转化为三甲胺，被肝黄素单加氧酶吸收，进一步氧化为三甲胺-N-氧化物，加重患者炎症反应。以上研究结果均提示，CRF患者肠道菌群失衡将促进组织炎症反应，加重肾组织纤维化，参与CRF的进程。

综上所述，CRF患者肠道菌群失衡，其条件致病菌丰度较健康者增加，且与血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平相关，提示肠道菌群失衡可能加重炎症反应与肾纤维化，参与CRF的进程。