阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的HPLC-PDA检测方法的建立

王 轩，韩宁宁，杨秀玉，戴 青，汪 霞，赵 晖

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

阿莫西林是一种半合成的青霉素类抗生素，具有抗菌谱广、耐酸性、制剂使用方便等特点，在兽医临床中普遍应用。其中，阿莫西林可溶性粉是由阿莫西林与无水葡萄糖配制而成的，用于治疗鸡对阿莫西林敏感的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染[1]。氟苯尼考是一种动物专用的酰胺醇类抗生素，是氯霉素的氟化衍生物，具有良好的抗菌能力。由于其抗菌谱广、毒性低、吸收迅速、用药后体内分布广泛等特点，多种氟苯尼考制剂被研发并应用于兽医临床中[2-3]。由此可见，氟苯尼考和阿莫西林在功能药效方面具有相似性。目前，对氟苯尼考的含量测定方法有高效液相色谱法[4]、超高效液相色谱-串联质谱法[5]和酶联免疫法[6]等。在监督检验工作中，通过筛查发现市售某企业的一批阿莫西林可溶性粉中非法添加了氟苯尼考，因此，参考《中国兽药典》2015年版一部氟苯尼考质量标准及相关检测方法[7-9]，选择氟苯尼考为测试药物，阿莫西林可溶性粉为目标制剂，采用高效液相色谱法与二极管阵列检测器，建立阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的HPLC-PDA检测方法，为打击兽药制剂非法添加氟苯尼考制假行为提供技术支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 Waters 2695高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器(PDA2998)和色谱工作站处理软件Empower 3(美国Waters公司)、AX205型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.2 试药 氟苯尼考对照品(含量99.1%，批号K0301703，中国兽医药品监察所)。

1.3 供试品

1.3.1 制剂空白 阿莫西林可溶性粉，某市售产品，为检验合格、无非法添加的产品，批号20190108，规格10%。

3.1.2 疑似阳性样品 阿莫西林可溶性粉，某市售产品，批号20200601，规格10%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Dikma Diamonsil C18(4.6×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈-水(33∶67，V/V)，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，二极管阵列检测器(PDA)，检测波长190～400 nm，记录224 nm波长处的色谱图。

2.2 溶液制备

2.2.1 空白溶液 制剂空白溶液：称取阿莫西林可溶性粉制剂空白样品1 g，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。溶剂空白溶液：流动相溶液。

2.2.2 对照品溶液 取氟苯尼考对照品约25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。置4 ℃冰箱保存。

2.2.3 供试品溶液 称取阿莫西林可溶性粉制剂1 g，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阳性添加样品溶液 称取阿莫西林可溶性粉制剂空白样品1 g，置50 mL量瓶中。取氟苯尼考对照品约12.5 mg，精密称定，加入同一量瓶中，用流动相溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 检测限溶液 称取氟苯尼考对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的溶液，作为氟苯尼考对照品溶液。取阿莫西林可溶性粉制剂空白供试品1.0 g，置50 mL量瓶中，平行制备3份，分别精密加入氟苯尼考对照品溶液1、2、4 mL，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.6 光谱数据库溶液 使用2.2.2项对照品溶液作为建立光谱数据库的溶液，建立氟苯尼考光谱数据库。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 通过空白试验排除阿莫西林可溶性粉制剂中主要成分对被测物的干扰。精密量取阿莫西林可溶性粉制剂空白溶液和氟苯尼考对照品溶液各10 μL，照2.1项色谱条件，注入高效液相色谱仪中，同时记录色谱图和光谱指数图(图1～图3)。结果表明，阿莫西林可溶性粉制剂本底在氟苯尼考峰保留时间附近无干扰。

图1 阿莫西林可溶性粉制剂空白溶液的光谱色谱图

图2 氟苯尼考对照品色谱图(50 μg/mL)

图3 阿莫西林可溶性粉中添加氟苯尼考的光谱图

2.3.2 线性 取氟苯尼考对照品约20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为氟苯尼考对照品储备溶液。精密量取氟苯尼考对照品储备溶液5、5、5、5、5、1、1 mL置于10、20、50、100、200、100、200 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得，制备成浓度为100、50、20、10、5、2、1 μg/mL的标准曲线溶液，照2.1项色谱条件测定，每个浓度点平行测定两次。按氟苯尼考峰峰面积与对应的浓度作标准曲线，并计算回归方程和相关系数。氟苯尼考回归方程为y=21986x-2528.1，R2=1.000。表明氟苯尼考在浓度为1～200 μg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3.3 检测限 本方法以光谱图最大失真浓度的二倍作为本方法的检测限，并保证检测限浓度下样品与对照品溶液的保留时间一致(差异小于等于±5%)，最大吸收波长一致(差异小于等于±2.4 nm)，色谱峰的纯度角度小于纯度阈值，PDA匹配角度小于PDA匹配阈值。将检测限试验溶液中氟苯尼考峰与光谱数据库进行匹配，结果显示，浓度低时光谱指数图会发生轻微变形，且匹配角度与匹配阈值的数值均变大。当添加量为最大失真浓度(0.2 g/kg)及以上的溶液时，氟苯尼考PDA匹配角度均小于PDA匹配阈值。虽然光谱指数图发生轻微变形时仍能实现与光谱库中对照品光谱的匹配，但考虑到兽药非法添加量一般都较大，本检验方法仍以光谱图失真的最大浓度的二倍作为方法的检出限，即氟苯尼考检出限为0.4 g/kg。

2.3.4 阳性样品测定 取阿莫西林可溶性粉阳性样品，照2.2.3项配制供试品溶液，氟苯尼考对照品溶液的浓度调整为峰面积与供试品溶液相当。分别精密量取10 μL，注入高效液相色谱仪，照2.1项色谱条件，同时记录色谱图和光谱图。结果显示，供试品溶液在与氟苯尼考对照品峰保留时间一致处出峰；该色谱峰纯度角度小于纯度阈值，为单一物质峰；将其光谱与氟苯尼考对照品的光谱匹配，匹配角度小于匹配阈值，说明与氟苯尼考对照品的光谱相似，且两者最大吸收波长一致。以上结果表明样品中检出氟苯尼考(表1)。

表1 氟苯尼考峰纯度及光谱相似度检查结果表

2.3.5 准确度 通过阳性样品制剂与空白样品制剂中分别加入氟苯尼考对照品做回收率试验考察方法的准确度。取阿莫西林可溶性粉阳性样品，照2.2.3项配制供试品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，照2.1项色谱条件测定。重复测定2次。阳性样品回收率溶液：取阿莫西林可溶性制剂阳性样品1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，分别添加三份不同质量(约10.6、13.0、15.6 mg)的氟苯尼考对照品，精密称定，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10 μL，注入液相色谱仪，照2.1项色谱条件测定。每个浓度重复3次。结果见表2。空白样品回收率溶液：取阿莫西林可溶性粉空白样品1 g，置50 mL量瓶中。取氟苯尼考对照品约12.50 mg，精密称定，加入同一量瓶中，用流动相溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10 μL，注入液相色谱仪，照2.1项色谱条件测定。重复测定6次。结果见表3。阿莫西林可溶性粉制剂阳性样品中，氟苯尼考在三个浓度水平的回收率分别为102.6%(RSD=0.4%)、100.0%(RSD=0.4%)和98.6%(RSD=0.6%)，阿莫西林可溶性粉制剂空白样品中氟苯尼考的回收率为100.4%(RSD=0.5%)。

表2 阳性样品回收率结果

表3 空白样品回收率结果

2.3.6 耐用性 以回收率试验溶液作为耐用性试验溶液。从柱温、流动相组成、色谱柱三方面考察阿莫西林可溶性粉制剂中氟苯尼考检测方法的耐用性。调节柱温为25、30、35 ℃，结果表明，随着柱温升高，氟苯尼考峰的保留时间逐渐前移。在三种柱温条件下，氟苯尼考峰纯度角度均小于纯度阈值，PDA匹配角度均小于PDA匹配阈值，与阿莫西林峰的分离度、理论塔板数均符合要求；调节流动相组成为乙腈-水(28-72)、乙腈-水(33-67)和乙腈-水(38-62)，结果显示，在不同流动相组成下，氟苯尼考峰的纯度、理论塔板数和分离度均符合要求；选择3款不同品牌色谱柱(Dikma Diamonsil，4.6 mm×250 mm，5 μm；Alltima，4.6 mm×250 mm，5 μm；Agilent Zorbax，4.6 mm×250 mm，5 μm；)，考察不同色谱柱对测定的影响，三款色谱柱结果显示，氟苯尼考纯度角度均小于纯度阈值，PDA匹配角度均小于PDA匹配阈值，且分离度均符合要求。

3 讨论与结论

3.1 提取波长的确定 采用二极管阵列检测器，对190～400 nm波长范围进行紫外吸收扫描。氟苯尼考在192 nm和223 nm处存在最大吸收，后者吸光度较低。但由于200 nm以下的光可被溶剂吸收，易造成误差。同时，参考《中国兽药典》2015年版一部中氟苯尼考含量测定方法，氟苯尼考的检测波长均为224 nm。本实验中检测波长为223 nm是由于PDA检测分辨率为1.2 nm造成，故选择224 nm作为提取波长。

3.2 流动相的选择 《中国兽药典》2015年版收载了氟苯尼考及其相关制剂有关物质及含量的测定条件，均为高效液相色谱法，以乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3)为流动相，检测波长224 nm。现有文献报道的氟苯尼考测定方法中，以高效液相色谱方法为主。综合参考《中国兽药典》和文献报道的方法，当流动相中加入冰醋酸后，光谱指数图在低波长处会出现不规则锯齿，从而造成光谱图失真[10]。本检验方法以光谱图失真的最大浓度的二倍作为方法的检出限，加入冰醋酸后会导致检测限升高。因此，本检查方法选择使用乙腈-水(33∶67)为流动相，对阿莫西林可溶性粉制剂中的氟苯尼考进行测定。

3.3 检查方法的扩展使用 除阿莫西林可溶性粉制剂外，当采用该检测方法用于其他兽药制剂的检查时，应进行空白试验和检测限测定。必要时，可调整供试品溶液或对照品溶液的浓度，使两者峰面积相似。通过与对照品溶液色谱图保留时间、光谱图的对比，确定供试品中是否含有氟苯尼考。

3.4 保留时间、峰纯度检查与光谱相似度检查 目标组分保留时间是否一致是判断两个色谱峰是否为同一化合物的初步依据，峰纯度检查可以判断该峰是否为单一物质峰，光谱相似度检查可以排除保留时间一致但紫外光谱不同的化合物的干扰。本实验以阳性样品和制剂空白中加入氟苯尼考对照品(以回收率试验溶液和检出限溶液替代)进行保留时间、峰纯度检查和光谱相似度检查。在与氟苯尼考对照品溶液峰保留时间一致处出峰，且纯度角度小于纯度阈值，匹配角度小于匹配阈值，从而证明在该色谱系统条件下，对阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的检查方法具有可行性。

本方法建立了HPLC-PDA法检测阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的检查方法，综合保留时间、最大吸收波长、峰纯度检查和光谱相似度检查四方面信息，实现了兽药中非法添加物的准确识别。该方法操作简便、快速、灵敏度高，为打击兽药制剂非法添加氟苯尼考制假行为提供了有力的技术支持。