禽腺病毒12个血清型代表毒株的分子生物学鉴定研究

侯力丹，宋佳诚，刘 丹，毛娅卿，杨亚希，黄小洁，吴应凯，王 嘉*，李俊平*

(1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3. 国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳 471000)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，曾称为I群FAdV，可根据其分子生物学特征及限制性内切酶片段图谱等方法分为A～E共5个种，12个血清型[1]，其多个种和血清型的特征为FAdV的鉴定、检验及诊断方法建立和相关疫苗评价等带来很大挑战。FAdV可引起鸡包涵体肝炎(IBH)、心包积液综合征(HPS)和肌胃糜烂 (GE) 等病症，严重影响养禽业[2-4]。自2015年6月以来，我国山东、河南、河北等省份的部分地区鸡群中发生了由血清4型FAdV引起的以心包积液和肝脏肿大为特征的传染病，被称为鸡心包积液-肝炎综合征(HHS)[5-7]。近期也报道了血清4型的I群FAdV在水禽中的感染病例[8]。除血清4型外，FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型在我国鸡群中均有流行和感染，对我国养禽业造成严重影响[9-10]。目前，我国尚无商品化FAdV疫苗及诊断制品。因此，建立12个血清型FAdV代表毒株库对于FAdV疫苗及诊断制品研发、评价等具有重要意义。

我国于20世纪70年代从国外引进了12个血清型毒株[11]，但一直未进行系统鉴定。本研究针对FAdV不同种的Hexon和Fiber序列设计引物，拟经PCR扩增和遗传进化分析，对12个毒株进行基因分种鉴定。再结合同一种中不同血清型病毒Hexon序列上酶切位点的特征，通过限制性内切酶进行酶切，得到不同的酶切片段，确定同一种内不同血清型的病毒毒株种是否纯净，进一步完善12个血清型代表毒株毒种库。

1 材料和方法

1.1 毒株和试剂 FAdV的12个血清型毒株由中国兽医药品监察所国家兽医微生物菌种保藏管理中心保存。Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自康宁生命科学有限公司。快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Ⅱ型购自北京百泰克生物技术有限公司。TOP10感受态细胞、质粒小提试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司。LB琼脂、LB肉汤购自北京中海生物科技有限公司；pESAY-Blunt Simple Cliong Vector购自北京全式金生物技术有限公司。Acc65 Ⅰ、Hpa-Ⅰ、BsaBⅠ、AlwNⅠ、SacⅡ限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司。KOD FX Neo 购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。2×Taq PCR Master Mix购自北京博迈德生物技术有限公司。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank上FAdV不同型的参考毒株(表1)序列设计引物，用于扩增不同种FAdV的Hexon基因和Fiber基因全长片段，引物信息分别见表2和表3。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表1 FAdV的12种血清型参考毒株信息

表2 针对FAdV不同种Hexon全长基因扩增所需引物序列

表3 针对FAdV不同种Fiber全长基因扩增所需引物序列

1.3 FAdVHexon基因和Fiber基因的PCR扩增 使用DNA提取试剂盒分别提取12个血清型病毒DNA。以提取的DNA为模板，每对Fiber引物扩增所有毒株，Hexon引物扩增对应种的毒种。PCR反应体系为上下游引物各3 μL，KOD FX Neo 1 μL，KOD FX Neo buffer 25 μL，dNTP 10 μL，ddH2O 9 μL。

PCR反应条件为 94 ℃预变性2 min，98 ℃ 15 s，退火30 s，68 ℃ 按2000 bp/min延伸，共35个循环，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存，同时设置阴性对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后使用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。

1.4 FAdVHexon基因和Fiber基因序列测定及遗传进化分析 将上一步得到的FAdVHexon基因和Fiber基因全长片段的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，并用DNA STAR软件对序列进行遗传进化分析。将待检毒株序列与参考毒株序列进行同源性比较和分析。

1.5Hexon基因的酶切鉴定 由于表3中的Fiber基因引物具有种特异性，所以前期通过对Fiber基因的PCR扩增，可实现对毒株种的分型和确定种的纯净性，并实现对血清1型(A种)和血清5型(B种)毒株的特异性和纯净性鉴定。通过PCR方法与酶切方法对Hexon基因全长进行鉴定，从而鉴定某一毒株内是否存在同种不同血清型污染。将1.3中各毒株Hexon基因的PCR产物进行胶回收，再使用不同的限制性内切酶将C、D、E种内不同血清型进行分型(表4)。选取Acc65Ⅰ分型C4与C10，选取HpaⅠ与BsaBⅠ分型D2、D3、D9、D11，选取AlwNⅠ和SacⅡ分型E6、E7、E8a、E8b。酶切体系为：胶回收产物20 μL，限制性内切酶1 μL，10×NEB Buffer 5 μL，H2O 24 μL。

2 结果与分析

2.1 目的基因Hexon的PCR扩增 利用本试验设计的Hexon基因和Fiber基因种特异性引物(表2、表3)对12个血清型FAdV毒株的Hexon和Fiber基因ORF全长进行PCR扩增，分别得到与预期目的片段大小一致的基因片段，阴性对照无特异性扩增，结果见图1和图2。而用Fiber其他种的引物扩增各毒株，结果均为阴性，证明各毒株无其他种病毒污染，且表3中的Fiber引物具有种特异性。

M: DL5000 DNA Marker; 1: A1-Hexon; 2: B5-Hexon; 3: C4-Hexon; 4: C10-Hexon; 5: D2-Hexon; 6: D3-Hexon;7: D9-Hexon; 8: D11-Hexon; 9: E6-Hexon; 10: E7-Hexon; 11: E8a-Hexon; 12: E8b-Hexon; 13: Negative control

M: DL5000 DNA Marker; 1: A1- Fiber1; 2: A1- Fiber2; 3: D2- Fiber; 4: D3- Fiber;5: C4- Fiber1; 6: C4- Fiber2; 7: B5- Fiber; 8: E6- Fiber; 9: E7- Fiber; 10: E8a- Fiber;11: E8b- Fiber; 12: D9- Fiber; 13: C10- Fiber1; 14: 10- Fiber2; 15: D11- Fiber

2.2 不同种毒株Fiber的遗传进化分析Fiber(Fiber2)基因ORF全长的核苷酸序列分析(图3、图4)显示，A1、D2、D3、D11、E8a、E8b 六个毒株与相应参考毒株的同源性高达100%，E6、E7、D9三个毒株与相应参考毒株的同源性达99.9%，C4毒株与相应参考毒株的同源性为99.3%，B5毒株与相应参考毒株的同源性为95.8%，C10毒株与相应参考毒株的同源性为99.1%。同时，同种毒株间C4和C10同源性高，为96.9%，D3和D11同源性最低，为72.5%。而不同种毒株间表现为较低的同源性，其中A1与E7、E8a、E8b之间同源性最低，为4.9%。根据Fiber引物的特异性扩增结果，可对A1和B5型的毒株进行分型鉴定。

图3 FAdV 不同血清型毒株Fiber基因遗传进化分析

图4 FAdV 不同血清型毒株Fiber基因同源性比较

2.3 不同种毒株Hexon基因的遗传进化分析 将Hexon基因ORF全长的PCR产物进行测序，并用DNA STAR软件进行分析(图5、图6)。结果显示，C10、D2、D3、D11、E8a、E8b 六个毒株与FAdV参考毒株的同源性高达100%，其余毒株与参考毒株之间的同源性在99.1%到99.9%之间。B5与参考毒株340株的同源性相对较低，为77.3%。同时，同一种各毒株间D2和D11同源性最高，为99.1%，D2与D3或D11同源性最低，为80.4%。而不同种毒株间表现为较低的同源性，其中B5与C4同源性最低，为71.4%，与其余血清型毒株的同源性最高为76.6%。

图5 FAdV 不同血清型毒株Hexon基因遗传进化分析

图6 FAdV 不同血清型毒株Hexon基因同源性比较

2.4 不同血清型毒株Hexon基因的酶切鉴定分析

2.4.1 FAdV-C种Hexon基因酶切结果 FAdV-C4-Hexon与FAdV-C10-Hexon的PCR回收使用Acc65Ⅰ酶切后，FAdV-C4-Hexon被切成三段，长度分别为1505 bp、935 bp、700 bp，而FAdV-C10-Hexon被切成两段，长度分别为2439 bp和700 bp，与预期片段大小相符，酶切图谱见图7。

M: DNA Marker 2000; 1: FAdV-C4-Hexon Acc65Ⅰ酶切片段; 2: FAdV-C10-Hexon Acc65Ⅰ酶切片段

2.4.2 FAdV-D种Hexon基因酶切结果 FAdV-D2-Hexon、FAdV-D3-Hexon、FAdV-D9-Hexon、FAdV-D11-Hexon使用HpaⅠ酶切后，FAdV-D3-Hexon未被切开，FAdV-D9-Hexon 切为1159 bp和2136 bp两条带，FAdV-D2-Hexon、FAdV-D11-Hexon被切成2331 bp、500 bp和400 bp三条带。再将FAdV-D2-Hexon和FAdV-D11-Hexon使用BsaB Ⅰ酶切，FAdV-D2-Hexon未被切开而FAdV-D11-Hexon被切成2717 bp和571 bp，与预期片段大小相符。酶切图谱见图8。

M: DNA Marker 5000; 1: FAdV-D2 HpaⅠ酶切片段; 2: FAdV-D3 HpaⅠ酶切片段; 3: FAdV-D9 HpaⅠ酶切片段; 4: FAdV-D11 HpaⅠ酶切片段; 5: FAdV-D2 BsaBⅠ酶切片段; 6: FAdV-D11 BsaBⅠ酶切片段

2.4.3 FAdV-E种Hexon基因酶切结果 FAdV-E6-Hexon、FAdV-E7-Hexon、FAdV-E8a-Hexon、FAdV-E8b-Hexon使用AlwN Ⅰ酶切后FAdV-E6-Hexon 未被切开，FAdV-E8b-Hexon 切为2162 bp和1024 bp两条带，FAdV-E7-Hexon、FAdV-E8a-Hexon被切成1232 bp、1021 bp和932 bp三条带。再将FAdV-E7-Hexon和FAdV-E8a-Hexon使用SacⅡ酶切后， FAdV-E7-Hexon被切为273 bp和2918 bp两条带，而FAdV-E8a-Hexon则被切成2368 bp、547 bp和277 bp三条带，与预期片段大小相符。酶切图谱见图9。

M: DNA Marker 5000; 1: FAdV-E6 AlwNⅠ酶切片段; 2: FAdV-E7 AlwNⅠ酶切片段;3: FAdV-E8a AlwNⅠ酶切片段; 4: FAdV-E8b AlwNⅠ酶切片段;5: FAdV-E7 SacⅡ酶切片段; 6: FAdV-E8a SacⅡ酶切片段

3 讨论与结论

病毒分离鉴定、PCR及测序分析、琼脂扩散试验、病毒中和试验等病原学和血清学方法是FAdV鉴定及感染诊断的常用方法[1,12]。相关方法的建立和验证等需要背景清楚且纯净的FAdV相关标准毒株、核酸及特异性血清，其中标准毒株是基础。Hexon蛋白作为禽腺病毒的主要结构蛋白之一，具有种及血清型特异性抗原决定簇，也与致病性密切相关。同时，在病毒感染中Fiber最先与细胞表面的受体结合，且具有较好的免疫原性，所以常被用于亚单位疫苗和检测试剂盒的研究[13]。FAdV的种与血清型的对应关系中，A种对应血清1型，B种对应血清5型，C种对应血清4、10型，D种对应血清2、3、9、11型，E种对应血清6、7、8a、8b型。有关种与血清型对应关系的分子生物学分析方法，有关学者已进行了多种尝试，获得了非常有意义的参考依据[14]。相比Hexon基因，Fiber基因在不同基因型毒株之间保守性更低，而在不同基因型内不同血清型间保守性相对较高，因此，用于分型鉴定研究更具参考价值。本研究首次设计了针对5个种的Fiber基因鉴定引物，通过对12个血清型毒株Fiber基因全长序列进行PCR扩增，来区分不同种的FAdV，证明了毒株种的特异性，且各毒株不存在种间交叉。进一步对12个毒株Hexon基因和Fiber基因测序结果的遗传进化分析，结果表明菌种库引进的毒株中B5与B种参考毒株340株之间同源性为95.8%，其余11个毒株与对应参考毒株Fiber同源性在99.1%至100%之间。由于GeneBank中未见B种TR22毒株相应的基因参考序列，目前菌种库中标注的TR22毒株Fiber序列与340毒株序列同源性为95.8%，与其它种的同源性仅为25.8%至56.6%，初步判定其为B种FAdV。而Hexon基因的分析结果表明，B5与参考毒株340株的同源性为77.3%，其余11个毒株与对应参考毒株Hexon基因同源性在99.1%至100%之间，进一步证明我所保存的毒株标注名称与参考毒株名称一致。

为确定毒株中是否污染同一种的其他血清型毒株，用酶切法对C、D、E种毒株的纯净性进行鉴定。根据不同血清型Hexon基因序列中酶切位点所在位置的差异，选取Acc65 Ⅰ、HpaⅠ、BsaB Ⅰ、AlwN Ⅰ、SacⅡ五种限制性内切酶，可以将C、D、E种的10个血清型毒株切为不同大小的片段样态，以此来实现对不同毒株的的区分和鉴定。通过酶切产物片段的大小可知，各毒株均未污染本种中其他血清型的毒株，纯净性良好。与之前研究中只用Hexon基因进行分型的方法相比[1]，遗传进化分析结合酶切法对FAdV 12个血清型毒株的Hexon基因和Fiber基因进行系统特异性和纯净性分析更为准确。

本研究表明，我国兽医微生物菌种保存中心保存的FAdV 12个血清型毒株纯净性好，且与国际参考毒株一致，遗传背景清晰可靠，为相应特异性血清制备、疫苗研发和相关检验诊断方法的建立提供了重要菌种资源。