外周血miRNA-124对前列腺癌患者临床和病理特征的影响及对预后判断的价值

李 炜，罗 雄

四川省巴中市中心医院泌尿外科,四川巴中 636001

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，2012年，我国肿瘤登记地区报告，前列腺癌发病率为9.92/10万，占男性恶性肿瘤发病率的第6位[1]。目前，临床普遍采用前列腺特异性抗原(PSA)作为前列腺癌的筛查及预后判断指标。但早在2014年，加拿大预防医疗护理专责小组就发布报告称，PSA用于筛查前列腺癌弊大于利，假阳性结果过多，应放弃使用[2-3]。因此，临床中迫切需要寻找到更多新的高敏感性及特异性的标志物。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码单链RNA分子，目前的研究表明，miRNA几乎参与了所有的细胞生物活动[4-5]。有研究表明，miR-1246在某些肿瘤组织中表达水平明显升高[6-7]，但关于血清miR-1246水平对前列腺癌患者的研究报道较少。因此，本研究收集了88例行手术治疗的前列腺癌患者为研究对象，探讨外周血miR-1246表达对患者临床特征的影响及对患者预后判断的价值，以期为前列腺的早诊断、早干预提供更多依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2016年1月巴中市中心医院收治的前列腺癌患者作为前列腺癌组。纳入标准：(1)均符合中华医学会泌尿外科学分会(CUA)编写的《中国前列腺癌诊断治疗指南》中有关前列腺癌的诊断标准；(2)均行根治性手术；(3)首次诊断并治疗；(4)术前未行放化疗、内分泌治疗等；(5)病历资料及随访资料完整。排除标准：(1)前列腺癌复发患者。(2)合并其他急慢性感染性疾病。(3)合并全身其他系统的恶性肿瘤。最终，88例患者被纳入前列腺癌组。同时，选取同期行手术治疗的62例单纯性前列腺增生患者作为增生组，以及60例健康志愿者为健康对照组。向患者或志愿者详细说明本研究的目的，纳入研究者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2试剂与仪器 总RNA快速抽提试剂盒购于杭州艾康生物技术有限公司，Trizol总RNA抽提试剂购于美国智雅生物技术有限公司，RNA逆转录试剂购于日本Takara公司，实时荧光定量PCR检测试剂盒购于美国Abcam公司，PCR引物由武汉博士德生物科技公司合成。

1.3方法

1.3.1外周血miR-1246的检测 患者入院后，抽取肘正中静脉血5 mL，3 000 r/min条件下离心5 min，分离血浆后低温冻存，健康志愿者血液标本采集方法及步骤相同。参照说明书提取总RNA，检测RNA浓度与纯度。反转录合成cDNA，实时荧光定量PCR检测miR-1246的相对表达水平。PCR中miR-1246的上游引物为5′-CCTACATCGCACCGGAGTCTG-3′，下游引物为5′-GCGAGCACAGAACATAATACGAC-3′；U6的上游引物为5′-CTCGCTACGCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-ACGCTFCACGAAT TTGCGAT-3′。反应体系为20 μL，反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，总计40个循环，设置3个重复孔。以U6作为内参基因，得到Ct值，采用2-ΔΔCt法计算外周血miR-1246相对表达水平。

1.3.2随访 采用门诊形式进行定期随访。术后第6周第一次门诊检测血清PSA，此后每3个月门诊随访一次，之后每半年随访一次。直至随访终点或失访，随访截止时间为2020年1月31日。以术后生化复发为主要随访终点，术后无生化复发定义为根治性手术后PSA降至最低值后，连续两次PSA高于0.2 ng/mL。

2 结 果

2.1miR-1246在3组人群中的表达水平比较 以U6为内参基因，miR-1246在前列腺癌组、增生组、健康对照组人群中的相对表达水平分别为2.62±0.89、1.35±0.51、1.25±0.48，两两比较后发现，前列腺癌组的miR-1246表达水平显著高于增生及健康对照组(P<0.05)，但增生组与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2miR-1246表达水平对患者临床、病理特征的影响 miR-1246表达水平对患者Gleason评分、T分期、N分期、M分期、危险因素分级有明显不良影响(P<0.05)，但与年龄、PSA水平无关(P>0.05)。见表1。

表1 miR-1246表达水平对患者临床病理参数的影响

续表1 miR-1246表达水平对患者临床病理参数的影响

2.3miR-1246对前列腺癌的潜在诊断价值评估 ROC曲线显示，miR-1246、PSA对诊断前列腺癌的最佳截断值分别为2.54、11.5 ng/mL。PSA对诊断前列腺癌的特异度、灵敏度、准确率分别为72.9%、62.1%、64.2%；miR-1246为47.9%、91.3%、82.7%，二者联合诊断时，特异度有所下降，但准确率明显上升。见表2。

表2 三种检测方式对肺癌的诊断效能

2.4miR-1246对前列腺癌患者总体生存率及无生化复发生存率影响 miR-1246相对表达水平的中位值为2.50，相对表达水平≤2.50为低表达组，相对表达水平>2.50为高表达组，Kaplan-Meier生存分析显示，两组患者的总体生存率差异无统计学意义(χ2=1.429，P=0.232)，但低表达组患者的无生化复发生存率显著高于高表达组，差异有统计学意义(χ2=4.26，P=0.039)。见图1。

注：A为总体生存率；B为无生化复发生存率。

2.5影响前列腺癌患者总体生存期及无生化复发期的危险因素分析 Cox分析结果显示，miR-1246表达水平、Gleason评分、术前PSA水平、病理分期是影响患者无生化复发期的独立性危险因素(P<0.05)。单因素分析显示，miR-1246表达水平、术前PSA水平、年龄是影响患者总体生存期的危险因素，但仅有年龄是独立性危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响前列腺癌患者总体生存期及无生化复发期的危险因素分析

续表3 影响前列腺癌患者总体生存期及无生化复发期的危险因素分析

3 讨 论

前列腺癌的发病率在各个国家、各种族间有明显差异，同一民族居住不同地区发病率可相差几倍，由此认为环境、生活方式对前列腺癌的发病有重大影响[8]。从形成肿瘤细胞发展到临床出现肿瘤症状往往要经过10～20年，如果能在早期识别前列腺癌的高危因素，普及特异性更高的筛查方式，则有可能降低前列腺癌的发病率或提高早期诊断率[9]。

miRNA广泛地参与了细胞的生物学活动。miR-1246是一种较为特殊的miRNA，可参与调控血管生成、肿瘤发生、血管壁纤维化等过程，更为特殊的是，在不同类型的肿瘤中可表现出抑瘤或促瘤的双向功能性，发挥类肿瘤基因或抑瘤因子作用[7,10]。前列腺癌中差异表达的miRNA已经被确定，这些miRNA的表达与雄激素信号以及临床病理因素有关。鉴于miRNA具有致癌或肿瘤抑制功能，miRNA可能成为癌症药物治疗的新竞争者。本研究中，miR-1246在前列腺癌组、增生组、健康对照组中的相对表达水平分别为2.62±0.89、1.35±0.51、1.25±0.48，两两比较后发现，前列腺癌患者的miR-1246相对表达水平显著高于前列腺增生组及健康对照组，但前列腺增生组与健康对照组的表达水平无明显差异。这表明，miR-1246在前列腺癌组织中表达水平显著上升，这与多种癌症类型中过表达一致[6,11]。进一步分析了miR-1246表达水平对患者临床、病理参数的影响，结果发现，miR-1246表达水平对患者Gleason评分、T分期、N分期、M分期、危险因素分级有明显影响。这表明miR-1246高表达可能参与了前列腺癌的发生、发展过程。

前列腺癌生化复发是指行根治性治疗后，患者血清PSA水平再次升高，目前通常将根治性手术后PSA≥0.4 ng/mL，或根治性放疗后在PAS最低值基础上PSA水平上升超过0.2 ng/mL定义为前列腺癌复发[12-13]。生化复发是前列腺癌进展为临床局部复发和远处转移的强烈信号，需要进一步行全面评估，以判断是否已发生临床复发[14]。与单纯生存率相比，生化复发预警检测对疾病更具治疗意义。在本研究中，通过Kaplan-Meier生存分析发现，低miR-1246表达组患者的无生化复发生存期显著高于高表达组。同时，Cox多因素分析也发现，miR-1246表达水平是影响患者无生化复发期的独立性危险因素。这表明，miR-1246表达水平是影响前列腺癌患者生化复发的危险因素，可作为早期预测的指标。

综上所述，本研究发现，miR-1246的高表达对前列腺癌患者的临床病例特征有一定的不良影响，且与患者的生化复发密切相关，有成为预测患者预后指标的可能。但本研究为单中心研究，样本量尚小，未来将在多中心研究的基础上实施更大样本量的研究，或能得出更具说服力的结论。