基于生物信息学分析卵巢癌免疫细胞浸润程度及其与预后的关系

熊 璐，苑雪萍，徐 冲，许 琳，韩旭东

北京市中关村医院病理科,北京 100190

卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤。尽管近年来卵巢癌的手术和化学疗法取得了较大进步，但是其发病率和病死率仍呈逐年上升的趋势。全世界每年新诊断出超过23万例患者和超过15万名女性死于卵巢癌[1-3]，卵巢癌患者的5年存活率仅为47%[4]。关于卵巢癌的治疗，肿瘤细胞减灭手术和化疗药物铂类、紫杉醇等治疗是晚期卵巢癌患者的一线疗法。这种标准治疗方案在晚期卵巢癌中的完全反应率可达40%～60%，但是在18个月后复发的患者超过了90%，并且出现对化疗药物耐药，最终死于卵巢癌[5]。由此可见，卵巢癌的预后仍有待进一步提高，探索新的治疗靶点和手段是十分必要的。

随着肿瘤免疫治疗的进展，肿瘤与免疫的相关性受到越来越多的重视，肿瘤中浸润的免疫细胞水平与肿瘤生长、进展和患者结局有关，成为近年研究的焦点[6-7]。从免疫学角度看，卵巢癌患者紊乱的免疫功能在肿瘤细胞的发生、发展中起着重要作用[8-9]。有学者提出了从复杂组织的基因表达谱中计算免疫细胞组成的方法，该方法在结直肠癌、肺癌、滤泡淋巴瘤中通过流式细胞术得到很好的验证，能大规模应用于基因表达谱数据的分析[10-11]。本研究利用GEO数据库中卵巢癌的表达谱数据，通过R软件计算了卵巢癌样本中免疫细胞的组成，并进一步分析了免疫细胞浸润与卵巢癌预后的关系。

1 资料与方法

1.1数据来源 本研究的卵巢癌芯片数据来源于GEO数据库的GSE63885数据集，GSE63885数据集中包含101例卵巢癌患者的组织RNA-seq测序数据(由GPL570平台注释)。本课题组下载该数据集RNA-seq的Counts矩阵，同时还包括患者临床分期、病理分级、生存状态、生存时间等信息。

1.2方法

1.2.1ssGSEA免疫基因集分析及免疫评分 通过ssGSEA算法计算每个样本的免疫浸润程度，下载分析所需要的gmt格式基因集数据后，使用R包GSVA对GSE63885中的样本进行免疫评分，共包含29项免疫相关评分。

1.2.2预后分析 使用survival程序包分析各项免疫评分与生存预后的关系。根据各项评分的中位数(作为界值)将患者分为高分组和低分组，然后筛选高分组与低分组预后生存情况差异有统计学意义(P<0.05)的免疫评分项并绘制生存曲线进行展示。

1.2.3采用Cibersort软件计算免疫细胞构成 采用limma应用程序包的Normalize Between Arrays函数对GSE63885卵巢癌测序数据进行校正，即组间归一化处理，校正后的数据通过Cibersort软件的“反卷积法”得到22种免疫细胞在肿瘤组织中的占比数据，根据P<0.05筛选预测合格的样本，绘制免疫细胞占比相关性热图，同时根据与预后相关的免疫评分项进行分组，绘制免疫浸润细胞小提琴图。

2 结 果

2.1卵巢癌样本临床信息 本研究项目的数据共包括101例卵巢癌患者信息。病理分级方面，G3的患者居多(占50.5%)；临床分期中，Ⅲ期患者较多(占63.4%)。此外，从乳腺癌易感基因1(BRCA1)和TP53基因突变情况可知，TP53基因突变是卵巢癌患者的主要特征，85.1%的患者检测到突变位点，另有30.7%的患者有BRCA1突变。见表1。

表1 卵巢癌患者临床信息[ n(%)]

续表1 卵巢癌患者临床信息[ n(%)]

2.2卵巢癌样本免疫评分 101例卵巢癌样本的免疫评分热图见图1。免疫细胞相关基因集有树突状细胞(DCs，分为aDCs、iDCs、pDCs)、抗原呈递(共抑制)细胞(APC co-inhibition)、抗原呈递(共刺激)细胞(APC co-stimulation)、B细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、共抑制T细胞(T cell co-inhibition)、共刺激T细胞(T cell co-stimulation)、辅助性T细胞(Th细胞，分为Th1细胞和Th2 细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、调节T细胞(Treg)；免疫分子相关基因集有趋化因子受体(CCR)、检查点(Check point)、细胞活化因子(Cytolytic activity)、人类白细胞抗原(HLA)、副炎症(Parainflammation)、促炎性因子(Inflammation promoting)、主要组织相容性复合体1(MHC classⅠ)、Ⅰ性干扰素(TypeⅠ IFN reponse)、Ⅱ性干扰素(Type Ⅱ IFN reponse)。

注：cells表示细胞；Mast cells为肥大细胞；Macrophages为巨噬细胞；Neutrophils为中性粒细胞。

2.3免疫评分预后分析 以各项免疫评分的中位数为界值，将患者分为高、低分组，结合患者的生存时间和生存状态数据，采用Kaplan-Meier Log-rank法对各项免疫评分与生存预后的关系进行分析。Tfh评分与患者的生存预后相关(P=0.026 7<0.05)，见图2，高Tfh评分组患者较低分组生存预后更佳。

图2 Tfh评分相关生存曲线

2.4卵巢癌免疫细胞浸润分析 通过Cibersort软件获得各样本的免疫细胞浸润比例，共66例样本符合筛选标准(P<0.05)，绘制66例样本的免疫细胞占比柱状图和免疫细胞占比相关性热图。卵巢癌组织中浸润水平较高的细胞是M2型巨噬细胞(0.180±0.085)%、浆细胞(0.114±0.090)%、CD8+T细胞(0.105±0.066)%。在卵巢癌组织中，免疫细胞占比相关系数(r)较大的包括γδT细胞和嗜酸性粒细胞(r=0.63，P<0.05)，嗜酸性粒细胞和Tfh(r=0.65，P<0.05)，Tfh分别与M1型巨噬细胞、γδT细胞呈较强正相关(r=0.54，P<0.05)，B记忆细胞和未成熟的B细胞呈负相关性(r=-0.51，P<0.05)，见图3。

注：B cells naive为未成熟的B细胞；B cells memory为记忆B细胞；Plasma cells为浆细胞；T cells CD8为CD8+T细胞；T cells CD4 naive为未成熟的CD4+T细胞；T cells CD4 memory resting为静息记忆CD4+T细胞；T cells CD4 memory activated为活化记忆CD4+T细胞；T cells follicular helper为Tfh；Tregs为调节性T细胞；T cells gamma delta为γδT细胞;NK cells resting为静息NK细胞；NK cells activated为活化NK细胞；Moncytes为单核细胞；Macrophages为巨噬细胞；Dendritic cells resting为静息树突细胞；Dendritic cells activated为活化树突细胞；Mast cells resting为静息肥大细胞；Mast cells activated为活化肥大细胞；Eosinophils为嗜酸性粒细胞;Neutrophils为中性粒细胞；**表示P<0.01，*表示P<0.05。

根据Tfh评分将患者分为Tfh高分组和低分组，比较两组间的免疫细胞浸润情况差异，绘制小提琴图，见图4。Tfh高分组的浆细胞、活化的NK细胞、M1型巨噬细胞浸润程度明显高于低分组(P<0.05)，而M2型细胞的浸润程度则明显低于低分组(P<0.05)。

注：B cells naive为未成熟的B细胞；B cells memory为记忆B细胞；Plasma cells为浆细胞；T cells CD8为CD8+T细胞；T cells CD4 naive为未成熟的CD4+T细胞；T cells CD4 memory resting为静息记忆CD4+T细胞；T cells CD4 memory activated为活化记忆CD4+T细胞；T cells follicular helper为Tfh；Tregs为调节性T细胞；T cells gamma delta为γδT细胞;NK cells resting为静息NK细胞；NK cells activated为活化NK细胞；Moncytes为单核细胞；Macrophages为巨噬细胞；Dendritic cells resting为静息树突细胞；Dendritic cells activated为活化树突细胞；Mast cells resting为静息肥大细胞；Mast cells activated为活化肥大细胞；Eosinophils为嗜酸性粒细胞;Neutrophils为中性粒细胞；**表示P<0.01，*表示P<0.05。

3 讨 论

本研究利用GEO数据集中卵巢癌患者的基因表达数据进行免疫评分，根据免疫评分中位数将卵巢癌患者分为高分组和低分组，发现Tfh评分与卵巢癌患者的生存预后相关，Tfh高分组患者较低分组预后更佳。Tfh是辅助B细胞功能的主要T细胞亚群，可通过抗原呈递与新激活的B细胞相互作用，Tfh与自身免疫性疾病、免疫缺陷和肿瘤等疾病密切相关。研究表明，Tfh在乳腺癌的炎性浸润灶内大量存在，Tfh的存在可以改善存活率，同时减弱免疫抑制[12]。在大肠癌中也有浸润性Tfh的报道，其水平与患者的生存时间呈正相关[13-14]。结合本研究的结果进行分析，Tfh在肿瘤组织中的高水平浸润可能有利于患者的预后。

本研究通过Cibersort软件分析了卵巢癌组织中免疫细胞的浸润比例，结果发现浸润水平最高的是M2型巨噬细胞。巨噬细胞是具有可塑性和多能性的免疫细胞，M2型巨噬细胞可分泌抑制性细胞因子白细胞介素(IL)-10和转化生长因子-β(TGF-β)等，从而下调免疫应答[15]。在肿瘤免疫微环境中，M2型巨噬细胞与肿瘤细胞免疫逃逸的发生密切相关。既往研究显示，卵巢癌细胞分泌多种细胞因子，使血液中的单核细胞聚集在卵巢癌组织中并分化为巨噬细胞。卵巢癌细胞可以分泌大量的巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)，从而诱导巨噬细胞向M2巨噬细胞极化[16]。Tfh高分组中浆细胞、活化的NK细胞、M1型巨噬细胞浸润程度明显高于低分组，而M2型巨噬细胞的浸润程度则明显低于低分组。通过对M2巨噬细胞的特异性标记分子进行免疫组织化学染色发现，M2巨噬细胞的数量越多，晚期卵巢癌患者的预后就越差[17]。通过对卵巢癌的M1和M2巨噬细胞进行免疫组织化学分析发现，M1/M2巨噬细胞比例较高的患者预后较好，这表明M2型巨噬细胞在卵巢癌的进展中起重要作用[18]。NK细胞是具有直接杀伤功能的天然免疫效应细胞，在清除肿瘤细胞中起关键作用，其潜在的癌症免疫治疗靶点引起人们的广泛关注[19-20]。本研究也显示，在Tfh高分组中活化NK细胞的浸润水平明显高于低分组，这可能也是Tfh高分组患者预后更好的原因。

本研究通过ssGSEA方法和Cibersort软件，利用基因表达数据分析卵巢癌免疫细胞浸润情况及其与预后的关系，发现卵巢癌中存在不同程度的免疫细胞浸润，Tfh可能为影响卵巢癌患者预后的因素。同时这种方法可以为研究免疫细胞浸润情况与肿瘤的关系提供新的研究手段。