miR-361-3p对儿童肺炎炎性损伤的保护作用及机制研究

刘 莉,张 军，李晓波

汉中市三二〇一医院：1.检验科；2.微免科，陕西汉中 723000

肺炎是一种常见的感染性疾病，在儿童中的发病率和病死率较高。2015年，全世界大约有70万名5岁以下儿童死于肺炎[1]。微小RNA(miRNA)作为一种小型非编码RNA，通过结合3′端非翻译区(3′UTR)调控其下游靶基因表达，参与细胞增殖、迁移、凋亡以及固有免疫、炎症和感染等过程[2-3]。研究发现，大量miRNA在儿童肺炎的炎性损伤中发挥重要作用[4-6]。肺部感染后，大量促炎性因子的产生可加重肺组织损伤[7]。有研究表明，miR-361-3p在克罗恩病中发挥重要作用[8]，但其在肺炎中的研究未见报道。本研究通过检测肺炎患儿血清中miR-361-3p表达，同时利用脂多糖(LPS)刺激人胚肺成纤维细胞WI-38构建肺炎损伤细胞模型，采用“敲减-回复”的研究策略探讨miR-361-3p对肺炎中促炎性细胞因子水平的影响，旨在为临床肺炎的治疗提供新的方向。

1 资料和方法

1.1一般资料 将20例3～5岁的肺炎患儿(女性10例，男性10例)纳入研究，患儿均根据临床表现、呼吸道症状、细菌感染及胸部影像学检查确诊为肺炎，来自本院急诊科，在采血前未接受任何治疗。另外，选取同期在本院进行体检的性别、年龄匹配与纳入研究肺炎患儿相匹配的健康儿童作为对照。所有参与研究儿童的合法监护人均对本研究知情同意，并签署知情同意书；研究通过本院伦理委员会审查批准。

1.2实验材料 人胚肺成纤维细胞WI-38购自中国典型培养物保藏中心(中国武汉)；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；LPS、MyD88抗体和GAPDH抗体购自Abcam公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒购自Bimake公司；白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1β酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Lipofectamine 3000试剂购自Invitrogen公司；一抗稀释液、SDS试剂盒、PBS购自碧云天公司。miR-361-3p模拟物、抑制物，pcDNA3.1-MyD88质粒(oe-MyD88)及各自的阴性对照(NC)由上海Gene Pharma公司合成。

1.3方法

1.3.1细胞培养和转染 WI-38细胞培养采用含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM培基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。采用转染miR-361-3p模拟物或抑制物提高或敲减WI-38细胞中miR-361-3p的表达，采用转染oe-MyD88在WI-38细胞中过表达MyD88。具体方法如下：将对数期的2×105个WI-38细胞接种于6孔板内,24 h后换新鲜培基,将50 nmol/L miR-361-3p模拟物、100 nmol/L miR-361-3p抑制物或2～4 μg oe-MyD88质粒加入6孔板内，同时加入Lipofectamine 3000试剂4.5 μL，培养48 h。细胞采用5 μg/mL LPS处理72 h，构建体外肺炎细胞模型。miR-361-3p模拟物序列为5′-TTA TCA GAA TCT CCA GGG GTA C-3′,miR-361-3p抑制物序列为5′-AAT GTC TTA GAG GAC CCC ATG-3′。

1.3.2qPCR检测 收集细胞，采用Trizol法提取总mRNA，按Bimake逆转录试剂盒说明书进行操作，获取cDNA。qPCR反应体系的配制：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 2 μL、ddH2O 3.6 μL。反应条件：95 ℃ 20 s预变性；95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s，共扩增45个循环。采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.3ELISA检测 采集肺炎组和对照组每位儿童的外周静脉血2 mL，离心取血清作为检测标本；收集经LPS处理和未经LPS处理(作为对照)的WI-38细胞上清液作为检测标本。用相应的ELISA试剂盒检测标本中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平，均按试剂盒操作说明进行操作，用酶标仪在450 nm处检测吸光度，根据标准品得到线性校准曲线，进行均一化水平计算。

1.3.4Western blot检测 收集待测细胞，用PBS洗两遍，加细胞裂解液80 μL置冰上裂解30 min，吸取液体，离心收集蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。取蛋白30 μg上样，进行SDS-PAGE电泳后转膜，用5%的脱脂牛奶3 ℃封闭1 h。MyD88抗体作为一抗按1∶1 000进行稀释，4 ℃孵育过夜。加HRP标记的二抗37 ℃避光孵育2 h，PBS-T反复洗涤，加ECL试剂，采用化学发光仪检测目的蛋白。

1.3.5荧光素酶报告基因试验 从美国国家生物信息中心(NCBI)数据库中下载人MyD88-3′UTR基因序列,采用Primer5.0软件进行引物设计。将含有miR-361-3p结合位点的MyD88、3′UTR野生型(WT)或突变型(MuT)片段插入psiCHECK-2载体中。取2×104个WI-38细胞接种于24孔板中，培养24 h。转染前更换新鲜培基，将脂质转染试剂Lipofectamine 3000与质粒及miR-361-3p模拟物溶液混合,共转染至WI-38细胞中。转染24 h后，用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1血清miR-361-3p和MyD88在肺炎患儿和健康儿童中的相对表达水平比较 与健康儿童比较，肺炎儿童血清miR-361-3p相对表达水平显著降低(P<0.05)，见图1A；与健康儿童比较，肺炎儿童血清MyD88相对表达水平显著升高(P<0.05)，见图1B；与健康儿童相比，肺炎儿童促炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平均显著升高(P<0.05)，见图1C。

2.2miR-361-3p减轻肺炎炎性损伤的体外模型研究 建立了LPS诱导的体外肺炎模型。在LPS损伤的WI-38细胞中，miR-361-3p表达水平比对照细胞显著降低(P<0.05)，见图2A。随后，采用miR-361-3p模拟物和miR-361-3p抑制物转染WI-38细胞，用LPS处理后检测miR-361-3p的表达，结果显示miR-361-3p模拟物能显著提高miR-361-3p表达，miR-361-3p抑制物显著降低了miR-361-3p的表达(P<0.05)，见图2B。ELISA结果显示，miR-361-3p模拟物降低了LPS损伤的WI-38细胞炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05)，见图2C～2E。miR-361-3p抑制物提高了LPS损伤的WI-38细胞炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05)。

2.3miR-361-3p下调MyD88的表达 为了探究miR-361-3p调控儿童肺炎炎性损伤的分子机制，本课题组采用TargetScan Human预测到MyD88为miR-361-3p的下游靶基因。MyD88基因的3′UTR与miR-361-3p序列互补(图3A)。采用荧光素酶报告基因实验进一步确认MyD88是否为miR-361-3p的直接靶基因。结果显示，在psiCHECK-2-MyD88-野生型中，miR-361-3p模拟物显著降低了荧光素酶的相对活性，而在psiCHECK-2-MyD88-突变型无明显变化(图3B)，表明MyD88是miR-361-3p的直接靶基因。此外，本课题组检测了经LPS处理的WI-38细胞中miR-361-3p和MyD88表达的关系。qPCR和Western Blot结果显示，miR-361-3p上调抑制MyD88 mRNA和蛋白的表达(图3C～3E)。

2.4MyD88在体外逆转miR-361-3p在肺炎炎性损伤中的保护作用 为了研究MyD88在miR-361-3p调控的儿童肺炎炎性损伤中的作用，本课题组检测了MyD88在经LPS处理的WI-38细胞中的表达，结果显示相较于未经处理的对照组细胞，LPS损伤的WI-38细胞中MyD88表达水平更高(P<0.05，图4A)。在WI-38细胞中过表达MyD88，MyD88的表达水平明显增加(P<0.05，图4B)。在过表达miR-361-3p的WI-38细胞中增加MyD88的表达，促炎性因子表达明显升高(P<0.05，图4C～4E)。表明MyD88能在体外逆转miR-361-3p在肺炎炎性损伤中的保护作用。

注：A为qPCR检测肺炎儿童和健康儿童血清miR-361-3p的相对表达水平；B为qPCR检测肺炎儿童和健康儿童血清MyD88的相对表达水平；C为ELISA检测肺炎儿童和健康儿童血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平；与健康儿童比较，**P<0.01,***P<0.001。

注：A表示LPS诱导的体外肺炎模型中miR-361-3p表达水平的变化；B表示转染miR-361-3p模拟物或抑制物对WI-38细胞miR-361-3p表达水平的影响；C～E分别表示转染miR-361-3p模拟物或抑制物对LPS诱导的体外肺炎模型细胞IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平的影响；*表示P<0.05,**表示P<0 .01,***表示P<0.001。

注：A表示miR-361-3p与MyD88的预测结合位点；B表示psiCHECK-2载体处理后，转染野生型或突变型miR-361-3p模拟物WI-38细胞的相对荧光素酶活性检测；C、D分别表示转染miR-361-3p模拟物或抑制物对LPS诱导的体外肺炎模型细胞MyD88的mRNA和蛋白表达水平的影响；E为肺炎患儿血清中miR-361-3p与MyD88表达的相关性(n=20)；**表示P<0.01,***表示P<0.001。

注：A表示LPS诱导的体外肺炎模型中MyD88相对表达水平的变化；B为WI-38细胞转染oe-MyD88后对MyD88相对表达水平的影响；C～E分别为miR-361-3p模拟物转染或联合oe-MyD88转染WI-38细胞对LPS诱导的体外肺炎模型中IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平的影响；**表示P<0.01,***表示P<0.001。

3 讨 论

肺炎是指由微生物及理化因素等造成的终末气道、肺泡及肺间质的炎症。最常见的为革兰阴性条件致病菌导致的肺炎[9]。儿童肺炎的发病率较高，且可引起多种严重并发症，影响儿童的发育，甚至导致死亡[10]。促炎性因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等的异常表达被认为是导致肺炎加重及发生并发症的主要因素，抑制促炎性因子的表达，可以减轻肺组织的损伤[11]。

有研究发现，miRNA在肺炎中发挥重要作用，miR-141在LPS诱导的WI-38成纤维细胞的炎性损伤中发挥保护作用[4]。此外，miR-1247通过靶向趋化因子CC配体抑制LPS诱导的A549细胞急性损伤[12]。而miR-194和miR-20a对儿童肺炎炎性损伤有促进作用。有研究报道，miR-361-3p是一种肿瘤调节因子，同时与多种其他疾病如强直性关节炎和麻风有关[8,13-15]。然而，miR-361-3p在肺部炎症中的表达情况尚不清楚，miR-361-3p在肺部炎症中的异常表达是否与炎性损伤相关尚鲜见报道。本研究发现肺炎儿童血清中miR-361-3p呈显著低表达，且miR-361-3p与促炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平呈负相关。为了进一步探究miR-361-3p与肺炎的关系，本课题组采用LPS刺激WI-38细胞建立体外肺炎模型，结果显示，经LPS刺激后，WI-38细胞中miR-361-3p表达水平降低。而在WI-38细胞中过表达miR-361-3p后，再采用LPS刺激，促炎性因子的表达水平明显下降，而降低miR-361-3p的表达，促炎性因子表达水平增加。这表明miR-361-3p在肺炎患儿中通过抑制促炎性因子的表达而发挥保护作用。

MyD88是Toll样受体(TLR)信号通路的关键连接分子，在疾病发生发展中发挥重要作用。MyD88被证实参与炎性肺损伤，包括肺炎。有学者发现MyD88促进了通气性肺损伤和炎症[16]。同时，SONEGO等[17]发现MyD88参与了铜绿假单胞菌诱导的肺部感染。本研究中,本课题组发现MyD88表达与miR-361-3p负相关，并参与了miR-361-3p介导的WI-38细胞炎性反应过程。此外，本课题组发现MyD88是miR-361-3p的直接靶点。在WI-38细胞中过表达MyD88可增加促炎性因子的表达。结果提示，miR-361-3p通过调控MyD88在WI-38细胞的炎性损伤中起保护作用。

综上所述，本研究发现增加miR-361-3p的表达在儿童肺炎的炎性损伤中具有保护作用。进一步探究miR-361-3p减轻LPS诱导的WI-38细胞炎性损伤的机制，可能为儿科肺炎的治疗提供新的治疗靶点。