NEC患儿肠道菌群的优势菌属及益生菌制剂疗效分析

李琳琳，张艳波，张称心

内蒙古医科大学附属医院儿内科，内蒙古呼和浩特 010050

新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是临床常见的小儿获得性疾病之一，有研究报道显示，NEC是由多种原因造成的肠道黏膜损伤性疾病，由于局部组织的缺血以及缺氧症状，最终导致患儿的小肠以及结肠发生弥漫性或局部坏死，严重影响患儿的生命安全[1]。流行病学调查显示，NEC主要好发于回肠远端以及结肠近端[2]。目前对于NEC疾病的研究尚不明确，但是多数研究显示，肠道的细菌感染是造成患儿疾病进展的重要因素，相比健康儿童，患儿的肠道菌群存在显著的异常，但是在以往的研究中，对于人体正常的菌群培养难度较大，对于菌群多样性的研究存在局限性[3]。随着分子生物学技术的不断进步，通过核酸检测手段对人体肠道菌群进行分析已经成了一种成熟的方法，这对于患儿的治疗有重要意义[4]。本研究对NEC患儿肠道菌群的菌属分布情况及益生菌制剂的疗效进行了分析，旨在为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年2月至2020年2月于本院治疗的30例NEC患儿作为观察组，男14例、女16例，日龄(18.37±3.23)d；另外，选取同期于本院体检的健康儿童30例作为对照组，男17例、女13例，日龄(18.43±3.51)d。两组间性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。采用随机数字表法，将观察组患儿又分为A组和B组，各15例，两组患儿的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有患儿家属均签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会审批通过。NEC患儿纳入标准：(1)符合Bell-NEC临床诊断标准[5]；(2)患儿的胎龄均在37周以上；(3)入院前未使用肠道益生菌制剂；(4)入院前未在其他医院进行治疗。排除标准：(1)肠道畸形；(2)新生儿肺炎；(3)高胆红素血症；(4)肠道先天性疾病；(5)慢性腹泻。对照组纳入标准：(1)无肠道疾病；(2)胎龄均在37周以上。排除标准：(1)肠道出现异常情况者；(2)入院前使用肠道益生菌制剂。

1.2方法

1.2.1肠道菌群的PCR检测及分析 采集纳入儿童的新鲜粪便标本，随后称取0.22 g粪便提取DNA,主要使用QLAamp STOOL minikit试剂盒进行，同时对儿童的DNA 16S rDNA V3高变区域进行PCR扩增，上游引物序列为5′-CGCCCCGGGCGCGCCCCCGGGCGCGGGCGCGCCCACGCG-3′，下游引物序列为5′-ATTACGCGTGCGTAC-3′。PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃扩增30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。扩增完成后，及时对儿童的扩增样品进行变性梯度凝胶电泳分析，然后，采用SYBR Green进行染色，30 min后，使用紫外透射仪器对儿童的凝胶色带进行观察，分析其优势条带[6]。

1.2.2治疗方案 A组患儿采用酪酸梭菌二联活菌散剂(山东科兴生物制品有限公司)联合奥曲肽(浙江苏泊尔制药有限公司)治疗，B组患儿仅采用奥曲肽治疗，两组患儿均治疗1周。对照组不采取任何治疗措施。

1.2.3粪便标本的培养 取患儿的新鲜粪便进行粪便培养，取上述标本1 mL，溶于99 mL灭菌生理盐水中，充分振荡摇匀，使用接种环分别对两组患儿样本接种于MRS培养皿中[8]，35～37 ℃培养72 h，通过菌落形态对肠道双歧杆菌、肠球菌、乳酸杆菌以及真杆菌的菌落数量进行统计。MRS培养皿由江苏康典提供，操作严格按照说明书进行。

1.3观察指标 (1)对观察组和对照组儿童的肠道菌群的丰富度进行比较。(2)对观察组和对照组儿童的肠道菌群优势菌属进行分析。(3)比较A、B两组患儿的治疗效果。治疗效果评价标准[7]：患儿大便次数以及性状恢复正常，临床症状消失为显效；临床症状明显改善，大便次数和性状改善则为有效；大便性状、次数以及临床症状均未达到明显改善则为无效。总有效率=(显效例数+有效例数)/总例数×100%。(4)比较A、B两组治疗前后的肠道菌群:分别对治疗前后的乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、真杆菌的菌落数进行比较。

2 结 果

2.1观察组和对照组肠道菌群丰富度比较 观察组患儿的肠道菌群的丰富度(7.36±2.33)显著低于对照组(14.16±2.31)，差异有统计学意义(t=11.352,P<0.001)。

2.2观察组和对照组肠道菌群优势菌属分析 观察组和对照组儿童肠道菌群优势菌属的条带相似度接近100%，观察组双歧杆菌、大肠埃希菌呈下降趋势，见表1。

表1 观察组和对照组儿童肠道菌群优势菌属分析

2.3A、B两组患儿的治疗效果比较 经过1周治疗后，A组患儿的治疗总有效率显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患儿的治疗效果比较[ n(%)]

2.4A、B两组患儿治疗前后肠道菌群的比较 治疗前，两组患儿粪便中的乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、真杆菌的菌落数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组患儿粪便中的乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、真杆菌菌落数比治疗前均有所升高(P<0.05)，且A组患儿乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、真杆菌菌落数高于B组(P<0.05)。见表3。

表3 两组患儿治疗前后肠道菌群的比较

3 讨 论

肠道菌群平衡对于机体维持健康状态具有重要的意义[9-11]。肠道菌群失调可能影响肠道细菌的正常生长及平衡，造成NEC的发生[12]。有研究报道，肠道菌群不仅有利于营养物质的吸收，同时通过对脂肪的分解，有利于脂肪组织在机体各脏器的有效分布，对于调节肠道上皮细胞的屏障作用具有积极的意义[13]。通过稳定的肠道菌群，加强肠道上皮细胞的屏障功能，建立先天性以及获得性免疫，对于机体维持正常的生理功能具有重要意义[14-15]。由于受到检查条件的限制，自然环境中99%的微生物培养都较难适用于常规检测[16]。通过对儿童标本进行传统微生物培养检测，仅能对儿童的肠道菌群中的个别菌属进行分析[17]，无法用于对儿童肠道菌群多样性的准确分析。随着分子生物学技术的不断发展，通过对肠道细菌核酸物质的分析，可以对肠道菌群进行完整分析，对了解疾病的发生机制具有重要意义。

本研究对健康儿童及NEC患儿的肠道菌群丰富度以及优势菌群进行了分析。观察组肠道菌群丰富度显著下降，而两组儿童肠道菌群的优势菌属的相似度接近100%。NEC患儿的肠道菌群中，双歧杆菌和大肠埃希菌均呈下降趋势。在疾病状态下，患儿的益生菌优势地位减弱[18]，这对于患儿的肠道上皮细胞损伤会有促进作用[19]。

在对NEC患儿的治疗中，奥曲肽不仅可以降低患儿胃酸以及消化液的分泌量，同时还减少了胃肠道的蠕动，进一步缓解了患儿的临床症状。这些作用在短期内虽然可以使患儿的临床症状得到有效缓解，但患儿的局部病灶由于上皮细胞坏死造成的炎性反应仍有可能得不到有效控制，同时，患儿肠道菌群失衡，致病性微生物的分泌物还会不断刺激患儿的上皮细胞。通过对患儿采用益生菌制剂辅助治疗，可改善患儿肠道菌群丰富度，对于维持益生菌的优势地位具有重要价值。本研究中，对患儿采用益生菌联合奥曲肽治疗，治疗后的患儿肠道菌群中益生菌的菌落数明显恢复，对于患儿康复具有积极作用。

综上所述，NEC患儿肠道菌群表现为双歧杆菌及大肠埃希菌降低的趋势，通过采用益生菌制剂辅助治疗，酪酸梭菌二联活菌散剂联合奥曲肽治疗患儿的效果更好，建议临床推广应用。但本研究纳入的样本量较小，还需要进一步地扩大样本量进行研究。