微小RNA-1265在鼻咽癌中的表达及诊断价值*

张余良,邓国庆，刘术舟，周安燕

海南省人民医院/海南医学院附属海南医院:1.耳鼻咽喉头颈外科;2.呼吸与危重症医学科，海南海口 570311

鼻咽癌是我国南方发病率极高的恶性肿瘤[1]，癌基因和抑癌基因平衡紊乱是鼻咽癌发病的重要因素。在鼻咽癌高发地区，约70%的鼻咽癌患者确诊时已经处于晚期。尽管鼻咽癌的诊断和治疗已经取得了较大进展，但约30%的高危患者存在复发的风险[2]。由于鼻咽癌的解剖位置较隐蔽且肿瘤细胞对射线较敏感，放疗仍是鼻咽癌的首选治疗方式。鼻咽癌5年生存率为87%～96%[3]。进一步探讨鼻咽癌的发病机制对提高鼻咽癌治疗效果具有重要的意义。微小RNA(miRNA)为一类小分子RNA，可与靶基因mRNA结合，调控基因表达[4-5]。鼻咽癌进展过程中存在多种miRNA的异常表达[6-7]。miR-1265是新近发现的小RNA分子,其在胃癌[8]、结直肠癌[9]及肺腺癌[10]中表达上调，同时血浆miR-1265可能是卵巢癌术后复发的标志物[11]。本研究旨在探讨miR-1265在鼻咽癌组织中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年8月在本院耳鼻喉头颈外科住院治疗的鼻咽癌患者60例作为研究组。研究组纳入标准：(1)年龄35～75岁；(2)具有详细的病历和随访资料；(3)病理诊断为鼻咽癌；(4)除鼻咽癌外不存在其他恶性肿瘤。排除标准：(1)术前存在严重心血管疾病或恶病质患者；(2)不愿意配合研究或无法配合者。研究组包括男34例、女26例，年龄44～74岁、平均(55.8±11.3)岁。选取同期于本院治疗的鼻咽部良性肿瘤患者共60例作为对照组，疾病类型包括鼻腔乳头状瘤(24例)、纤维瘤(20例)、血管瘤(3例)及鼻息肉(13例)。对照组包括男30例、女30例，年龄36～67岁、平均(52.3±12.1)岁。对照组纳入标准：(1)无恶性肿瘤病史；(2)鼻咽部CT或MRI检查无恶性肿瘤；(3)病理学检查符合鼻咽部良性肿瘤的诊断标准[12]。对照组排除标准与研究组相同。所有纳入研究的患者均经过电子鼻咽镜检查并采集组织标本，获得病理学确诊，TNM分期依据国际抗癌联盟第8版标准[13]。两组患者年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经过医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；CO2培养箱购自美国Forma 公司；细胞裂解液和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；超速离心机购自美国Sigma公司；PCR仪购自美国Bio-Rad 公司;酶标仪购自上海赛默飞世尔公司。组织和血清RNA提取试剂盒、Trizol试剂盒、反转录试剂盒、miR-1265 抑制剂和空白对照的干扰RNA、All-in-oneTMmiRNA qPCR 检测试剂盒、MAT1 mRNA qPCR 检测试剂盒购自美国Invitrogen公司。双荧光素酶报告基因分析实验检测试剂盒购自北京碧云天生物技术公司。

1.3方法

1.3.1两组患者的血液和组织标本收集 两组患者于入院后次日抽取上肢静脉血10 mL，离心后保存于-20 ℃冰箱待测。研究组的鼻咽癌组织标本(60例)和对照组的鼻咽部良性肿瘤组织标本(60例)保存于-80 ℃冰箱待测。

1.3.2两组患者组织和血清中miR-1265的相对表达水平检测 将两组患者组织标本匀浆用于RNA提取，血清标本直接用于提取RNA,采用Trizol试剂提取组织或血清中的总RNA。用紫外分光光度计于260 nm和280 nm波长处测定RNA提取液的吸光度(A)值，检测RNA纯度和浓度。采用反转录试剂盒进行RNA反转录，分别将2 μg RNA、1 μL Oligo(dT)和8 μL DEPC 水加入PCR 管中，微型离心机离心后混匀，按试剂盒说明书所列方法配制PCR反应体系：每组体系加入10 μL RNA模板，总体系为25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。miR-1265的相对表达水平检测采用All-in-oneTMmiRNA qPCR 检测试剂盒进行反应，以U6作为内参，应用2-ΔΔCT法计算miRNA的相对表达水平。

1.3.3靶基因预测 通过miRNA靶基因在线预测网站TargetScan预测miR-1265的靶基因，其原理是通过查找Mer位点与miRNA的种子区域的匹配来预测靶基因。

1.3.4miR-1265靶基因的验证 及双荧光素酶报告基因分析实验按试剂盒操作手册进行。简要步骤如下：取生长良好的鼻咽癌CNE-2细胞(来自于本实验室培养的细胞系)，分别转染miR-1265 抑制剂(miR-1265 inhibator)和抑制剂的空白对照，在转染miR-1265 inhibator后的细胞中分别转染含有转移相关蛋白1(MAT1)-3 UTR 野生型和突变型的质粒，检测转染后细胞内荧光素酶的相对活性。

1.3.5两组患者组织中MAT1 mRNA的相对表达水平检测 两组患者病理组织中RNA提取和检测方法同1.3.2，上下游引物分别为：5′-ACCTACAACCGATAGCTGCTG-3′和5′-TTCCGATCTGCTTGTACTGCA-3′。GAPDH为内参基因，应用2-ΔΔCT法计算MAT1 mRNA的相对表达水平。

2 结 果

2.1两组患者病理组织和血清中miR-1265相对表达水平的比较 研究组病理组织中miR-1265相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；研究组血清中miR-1265相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者病理组织和血清中miR-1265相对表达水平的比较

2.2鼻咽癌患者癌组织中miR-1265的相对表达水平与临床病理因素的关系 不同性别、年龄及病理类型患者间miR-1265的相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同TNM分期、病理分期和淋巴结转移的患者miR-1265相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 鼻咽癌患者癌组织中miR-1265相对表达水平与临床病理因素的关系

2.3组织和血清中miR-1265的相对表达水平对鼻咽癌的诊断价值 当病理组织中miR-1265截断值为0.895时，Youden指数最大，其诊断鼻咽癌的ROC曲线AUC为0.917，95%CI为0.878～0.946，灵敏度为87.3%，特异度为91.3%；当血清中miR-1265截断值为0.515时，Youden指数最大，其诊断鼻咽癌的ROC曲线AUC为0.717，95%CI为0.678～0.806，灵敏度为67.3%，特异度为71.3%，见图1。

图1 鼻咽癌患者组织和血清中miR-1265的相对表达水平诊断鼻咽癌的ROC曲线

2.4MAT1基因是miR-1265的靶基因 通过TargetScan寻找miR-1265的靶基因，结果发现MAT1 3′-UTR的835-845处含有保守的miR-1265同源位点，提示在多种肿瘤细胞中高表达的癌基因MAT1是miR-1265的靶基因，见图2A；双荧光素酶报告基因分析实验显示：转染MAT1野生型3′-UTR载体在miR-1265 inhibitor 刺激下萤火虫荧光素与海肾荧光素的比值明显下降(P<0.05)，而转染MAT1突变型3′-UTR载体在miR-1265 inhibitor刺激下萤火虫荧光素与海肾荧光素的比值差异无统计学意义(P>0.05)，MAT1为miR-1265的靶基因，见图2B。

2.5研究组和对照组中MAT1 mRNA 表达水平比较 研究组病理组织中MAT1 mRNA相对表达水平为0.731±0.311，对照组为2.413±0.425，研究组病理组织中MAT1 mRNA相对表达水平低于对照组，差异有统计学意义(t=9.498,P<0.001)。

注：A表示miR-1265与预测靶点MAT1的结合位点；B表示双荧光素酶报告基因分析实验验证miR-1265与MAT1的靶向结合；*表示P<0.05。

2.6MAT1 mRNA 和miR-1265的相关性 Pearson相关显示鼻咽癌组织中MAT1 mRNA与miR-1265的相对表达水平呈负相关(r=-0.943,P<0.001),见图3。

图3 鼻咽癌患者癌组织中MAT1 mRNA 和miR-1265的相对表达水平的相关性分析

3 讨 论

鼻咽癌好发于我国南方地区，发病率在头颈恶性肿瘤中居首位，以低分化鳞癌为主[14]。鼻咽癌早期症状复杂多样缺乏特异性，肿瘤部位常较为隐蔽，导致早期检出率较低，约为60%。鼻咽癌患者确诊时已经发生肿瘤细胞扩散和转移，导致治疗效果不佳，严重影响患者的生存[15]，探讨鼻咽癌发病机制和新的诊断方法对改善鼻咽癌患者预后意义重大。

miRNA是真核细胞内无编码作用的小RNA，仅由19～25个核苷酸序列组成，在肿瘤细胞的凋亡、迁移、增殖等过程中发挥调控作用[16]。miR-1265是最新鉴定的微小RNA，在结直肠癌高通量测序中发现其在癌组织中表达水平高于癌旁组织[9]。最新研究发现在胃癌患者癌组织中 miR-1265相对表达水平较癌旁组织上调，其血清中miR-1265相对表达水平也高于健康人群[8]，体外研究发现miR-1265表达上调可促进胃癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡，减弱癌细胞中自噬蛋白表达，促进胃癌的进展，发挥致癌基因的作用。

本研究发现鼻咽癌癌组织中miR-1265相对表达水平较鼻咽部良性肿瘤组织显著上调，同时鼻咽癌患者血清中miR-1265相对表达水平也高于鼻咽部良性肿瘤患者，提示其可能在鼻咽癌中发挥促癌作用。进一步的研究发现鼻咽癌组织中miR-1265的相对表达水平与TNM分期、病理分期和淋巴结转移等恶性肿瘤的临床病理特征相关，其中TNM分期越晚、病理分期为进展型和存在淋巴结转移的患者癌组织中miR-1265的相对表达水平较高，提示miR-1265 可能参与鼻咽癌进展，而miR-1265 的相对高表达代表鼻咽癌患者癌细胞存在较晚的临床分期、较高侵袭性及恶性程度。

鼻咽部肿瘤良恶性的鉴别诊断一直是临床研究的热点[17]。 鼻咽癌肿瘤部位常较隐蔽，诊断缺乏特异性，同时鼻咽部存在多种良性肿瘤，常导致鼻咽癌易漏诊和鼻咽癌早期检出率较低[18]。本研究发现鼻咽癌组织中miR-1265的相对表达水平可有效区分鼻咽癌和鼻咽部良性肿瘤，其诊断的AUC为0.917，灵敏度为87.3%，特异度为91.3%，进一步研究发现鼻咽癌血清中的miR-1265诊断鼻咽癌的AUC为0.717，灵敏度为67.3%，特异度为71.3%，有一定的诊断价值，且血清miR-1265 的相对表达水平不需要取得活检组织，具有成为鼻咽癌无创诊断标志物的潜能[19]。

MAT1基因是常见的致癌基因，其高表达与多种癌症发生、进展和预后密切相关[20]。MAT1 基因位于14q23.1 位点上，通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶7 (CDK7) 和细胞周期蛋白依赖性激酶H(CDKH)发挥作用，其高表达促进细胞增殖，且与乳腺癌预后密切相关[21]。在其他癌症中，如结直肠癌[22]和非小细胞肺癌[23]癌组织标本中的MAT1 基因表达水平有助于不良预后的判断，且MAT1 基因可能成为潜在的癌症治疗靶点。最新研究发现在鼻咽癌组织中MAT1 mRNA 和蛋白均在癌组织中低表达，而在癌旁组织中高表达，且可用于判断鼻咽癌的不良预后，提示MAT1 基因参与了鼻咽癌的进展[24]。本研究发现miR-1265的潜在靶基因是MAT1，采用双荧光素报告基因分析实验验证miR-1265潜在的靶基因是MAT1基因，而且鼻咽癌患者癌组织中MAT1 mRNA 的相对表达水平低于鼻咽部良性肿瘤患者，鼻咽癌患者癌组织中MAT1 mRNA 的相对表达水平与miR-1265相对表达水平呈负相关。本研究发现miR-1265的靶基因是MAT1 基因，是否可通过敲低miR-1265表达水平，进而上调MAT1 基因表达而治疗鼻咽癌尚待进一步研究。

综上所述，本研究发现鼻咽癌患者癌组织和血清中miR-1265表达上调，与鼻咽癌进展密切相关，且具有鉴别诊断鼻咽癌和鼻咽部良性肿瘤的能力，其靶基因是MAT1基因，且鼻咽癌组织中miR-1265相对表达水平与MAT1呈负相关。miR-1265和MAT1基因有应用于鼻咽癌诊断的潜在价值或成为鼻咽癌治疗的新靶点。