血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测对乙型肝炎相关早期肝细胞癌的诊断价值*

李 洪,冯雪晶,秦 维,庄恢勇

琼海市人民医院检验科，海南琼海 222000

肝细胞癌在所有肝癌病例中占较大比例，是全球五大常见恶性肿瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝细胞癌发生的主要危险因素。由于早期肝细胞癌临床诊断困难，只有30%～40%的患者能行根治性切除术治疗[2]。在目前的诊断方案中，甲胎蛋白(AFP)是筛选肝细胞癌的生物标志物[3]，但AFP的灵敏度仅为39%～56%，特异度为76%～93%，约三分之一的肝细胞癌患者不能通过AFP检测确诊[4]。微小RNA(miRNA)是一类具有19～22个核苷酸的内源性非编码单链RNA[5]。在乙型肝炎(简称乙肝)相关早期肝细胞癌患者中，外泌体miR-15b、miR-224、miR-501异常表达[6]。然而，关于上述几种miRNA能否作为诊断乙肝相关早期肝细胞癌的生物标志物国内未见报道，所以本研究对此进行了探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年12月本院收治的乙肝相关早期肝细胞癌患者120例作为肝癌组，男61例、女59例，年龄(53.56±5.62)岁；选取肝炎患者120例作为肝炎组，肝炎病毒检测为阳性，病程超过半年，有乏力、食欲缺乏、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状，男64例、女56例，年龄(52.61±8.23)岁。本研究中乙肝的诊断均符合《病毒性肝炎防治方案》中的相关标准[7]；乙肝相关早期肝细胞癌的诊断符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中的标准[8]。排除标准：(1)接受过相应的药物治疗；(2)有严重心、肾功能损害者；(3)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；(4)精神疾病患者；(5)同时患有其他癌症者。另外，将同期于本院接受体检的健康者120例作为对照组，男60例、女60例，年龄(50.65±10.59)岁。各组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获本院伦理委员会批准，且受试者均签署知情同意书。

1.2方法 抽取上述人群肘前静脉血20 mL，静置20 min后，以2 500 r/min离心15 min分离血清。取4 mL血清后，加入34 mL磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，移至超速离心管，经配平后于4 ℃以150 000×g离心70 min获取血清外泌体。采用外泌体RNA分离试剂盒(北京金优科技有限公司)进行RNA的提取：裂解外泌体后加入氯仿，静置后离心得到上层的水相RNA层，再加入无水乙醇沉淀RNA，经RWT缓冲液和RPE缓冲液洗脱后再用DEPC水收集得到RNA溶液。随即采用反转录试剂盒(昆明迪然科技有限公司)进行反转录制备cDNA。采用实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(北京吉田生物科技有限公司)配制扩增体系，进行qPCR检测，通过循环阈值(Ct值)计算miRNA的相对表达水平。

2 结 果

2.13组间血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501相对表达水平的比较 肝癌组和肝炎组患者血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501相对表达水平高于对照组，肝癌组高于肝炎组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组间血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501 相对表达水平的比较

2.2血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测用于乙肝相关早期肝细胞癌和肝炎鉴别诊断的效能 血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测用于乙肝相关早期肝细胞癌和肝炎鉴别诊断的效能指标见表2，截断值分别为1.384、0.749、0.960。

表2 血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测用于乙肝相关早期肝细胞癌和肝炎鉴别诊断的效能

2.3血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测用于乙肝相关早期肝细胞癌诊断的效能 血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测用于乙肝相关早期肝细胞癌诊断的效能指标见表3，截断值分别为0.558、0.227、0.274。

表3 血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测用于乙肝相关早期肝细胞癌诊断的效能

2.4血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501联合检测用于乙肝相关早期肝细胞癌的诊断 血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501联合检测用于乙肝相关早期肝细胞癌诊断的灵敏度为93.33%(112/120)，特异度为92.92%(223/240)，准确度为93.05%(335/360)。见表4。

表4 血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501联合检测用于乙肝相关早期肝细胞癌诊断的分析(n)

3 讨 论

慢性肝病有发展为肝细胞癌的可能，对慢性肝病患者而言这是严重的健康隐患。因此，肝细胞癌的早诊断、早治疗至关重要。本研究检测了3组人群的血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501水平，然后进行了ROC曲线分析，发现血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501联合检测用于乙肝相关早期肝细胞癌诊断的灵敏度为93.33%，特异度为92.92%，准确度为93.05%。本研究中，尽管各项指标单独检测的特异度和灵敏度并不低于联合检测，但是血清外泌体miRNA属于间接标志物，会受到患者各种因素的影响，联合检测能减少这些影响。

miRNA可在转录后调节基因表达，与许多生物学过程有关，如发育、细胞分化、增殖、凋亡和炎症[9]。在包括肝细胞癌在内的许多癌症中都发现了miRNA的异常表达，它们具有致癌或抑癌特性[10]。本研究发现，肝癌组患者血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501的相对表达水平明显高于肝炎组，而且肝癌组、肝炎组均明显高于对照组。抑制miR-224的表达可显著降低基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的基因和蛋白表达，MMP-2是促进肿瘤迁移的重要蛋白[11]，这说明肝细胞癌患者血清外泌体高表达miR-224可能与肝细胞癌的侵袭、迁移能力相关。另外，陈帅等[12]发现miR-501在肺腺癌标本中呈高表达，与本研究发现的miR-501在肝细胞癌患者血清外泌体高表达的现象一致；此外，上调miR-501表达可抑制其靶基因CYLD的表达，并进一步引起下游基因C-myc和Cyclin D1的表达升高，由此造成肝癌细胞的高增殖活性。由此可见，miR-224、miR-501可能与乙肝相关早期肝细胞癌的进展和转移有关。

外泌体是小的膜泡，大小为30～120 nm，来自内部多泡体(MVB)[13]。外泌体已经在包括血液、腹水、尿液和唾液在内的体液中被发现[14]。研究表明，外泌体非编码RNA以一种稳定的形式存在，不受内源性RNA酶的干扰，它们可能是细胞间通信的重要介质[15]。因此，相较于血清AFP的筛查，血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501更加稳定。外泌体包含不同的miRNA组分，这主要取决于不同的器官和疾病状态，这可能反映了器官组织起源细胞的分子特征[16]。肿瘤来源的外泌体含有肿瘤特异性的miRNA，它们在肿瘤进展和转移中发挥作用[17]。目前，AFP作为筛选肝细胞癌的生物标志物，灵敏度、特异度不够理想，本研究发现血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501检测在灵敏度和特异度方面均有明显优势。

综上所述，血清外泌体miR-15b、miR-224、miR-501可作为诊断乙肝相关早期肝细胞癌的潜在标志物。