LAMP芯片十三联法检测重症监护患者下呼吸道感染病原菌的应用价值*

李 晓，杨永泉，孙朝晖，张卫云

中国人民解放军南部战区总医院检验科，广东广州 510010

下呼吸道感染在世界十大死亡病因中排名第四，在发展水平较低的国家中，下呼吸道感染疾病在死亡原因中排名更靠前[1]，在我国也是最常见的疾病之一。肺炎作为全球感染性疾病最主要的死因之一，若发生在重症监护患者中，尤其需要引起重视。下呼吸道感染绝大多数以革兰阴性(G-)杆菌为主要致病菌，因此明确引起感染的病原菌，选择合理的抗菌药物治疗是临床迫切需要的[2]。目前临床鉴定病原菌的方法主要依靠细菌培养法，但烦琐又费时，而环介导等温扩增检测(LAMP)芯片法可在1～2 h内定性检测下呼吸道分泌物中的13种病原菌(包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌)，该技术可应用于细菌、病毒、真菌等一系列病原微生物的检测[3-4]，大大提高了呼吸道感染的病原学诊断水平，可及时指导医师合理使用抗菌药物[5-6]。LAMP芯片法与痰培养法比较，前者具有特异度和灵敏度较高的优势，对于培养周期长或者难培养的病原菌可进行快速鉴定，对指导临床治疗具有较高价值[7-8]。本研究拟采用LAMP芯片法检测重症监护患者下呼吸道感染病原菌，并与痰培养法进行比较，探讨2种方法检测的一致性和临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年6月至2019年12月本院重症监护病房疑似下呼吸道感染患者67例，其中男49例、女18例，平均年龄(68.3±22.1)岁，采集深部痰液和肺泡灌洗液标本。应用LAMP芯片法检测上述患者的13种常见下呼吸道病原菌，对同一患者还同时进行痰培养检查，比较2种方法的差异，对检测结果的一致性进行分析。

1.2仪器与试剂 LAMP芯片法仪器和试剂均为北京博奥生物集团有限公司生产，包括核酸分析仪、呼吸道病原菌核酸检测试剂盒和恒温扩增芯片。用于液化痰液的10%NaOH溶液由本科室自行配制。痰培养病原菌鉴定采用法国生物梅里埃公司生产的API微生物分析系统及配套试剂。

1.3方法

1.3.1样本收集 采用经气管内吸痰取深部痰液或者肺泡灌洗液，样本量不少于0.6 mL置于无菌容器内于2 h内送检，在所有患者暂未使用抗菌药物治疗时进行。

1.3.2样本检测 LAMP芯片法：痰液或肺泡灌洗液标本中按1∶1加入10%NaOH溶液，静置30 min左右，待标本完全液化后取1 mL液体按试剂盒说明书操作步骤提取核酸，提取好的核酸加入恒温扩增芯片中，上机检测[9-10]。痰培养法：痰液或肺泡灌洗液在平板上接种后置于37 ℃二氧化碳温箱中培养，将生长的优势菌确定为致病菌，然后采用全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

1.4结果判断 LAMP芯片法可同时完成13种下呼吸道常见病原菌的靶基因扩增和检测，扩增芯片内设有1个阳性内参和9个阴性质控及1个人基因组DNA用于检测质控，结果判读时阳性质控应为阳性，阴性质控结果均为阴性，且阳性标本呈典型的S形扩增曲线可判断结果为阳性。根据《全国临床检验操作规程》第 3版规定，痰培养采用密集划线法进行计数培养，以菌落数≥104CFU/mL为阳性，<104CFU/mL为污染[11]。

1.5统计学处理 采用SPSS21.0软件分析数据，列表方法分析菌株分布，痰培养法与LAMP芯片法阳性率比较采用χ2检验；采用Kappa检验进行一致性分析，Kappa>0.40为具有一致性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1LAMP芯片法检测菌株分布 67例重症监护病房下呼吸道感染患者，LAMP芯片法检出病原菌阳性52例，阳性率77.61%(52/67)。检出菌株114株，包含9种病原菌，其中革兰阳性(G+)菌占24.56%(28/114)，G-菌74.56%(85/114)。未检出肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌及肺炎链球菌，见表1。检出单菌株21例、混合菌株31例，其中2种菌株14例，3种菌株9例，4种菌株5例，5种、6种及7种混合菌株各1例，见表2。

表1 LAMP芯片法检测病原菌菌株分布[ n(%)]

表2 LAMP芯片法检测出的单菌株/混合菌情况

2.2痰培养法检测菌株分布 重症监护病房下呼吸道感染患者标本67例，其痰液标本培养以检出优势菌株判定为阳性，共检出阳性44例，阳性率65.67%(44/67)。检出菌株44株，包含7种病原菌，其中G+菌占4.54%(2/44)，G-菌占93.19%(41/44)。未检出大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌及肺炎链球菌病原菌，见表3。

表3 痰培养法检测病原菌菌株分布

2.3LAMP芯片法与痰培养法阳性率比较 LAMP芯片法检出下呼吸道感染病原菌阳性率高于痰培养法(77.61%vs.65.67%)，差异有统计学意义(χ2=20.589，P<0.05)。2种方法检出病原菌的阳性符合率较一致(Kappa=0.567)，见表4。分析2种方法检测各菌种的一致性，LAMP芯片法与痰培养法对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、结核分枝杆菌检测具有一致性(Kappa>0.40)，而对耐甲氧西林葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的检测不具有一致性(Kappa<0.40)，见表5。

表4 LAMP芯片法与痰培养法检测病原菌的一致性分析(n)

表5 LAMP芯片法与痰培养法检测各病原菌结果的一致性分析(n)

3 讨 论

下呼吸道感染是重症监护病房患者最常见的疾病之一，严重影响患者康复，不容忽视。细菌是下呼吸道感染病原菌的重要组成部分，痰培养法在检测下呼吸道病原菌的灵敏度和检测时间上难以满足临床患者的要求。本研究采用的LAMP芯片法同时检测13种下呼吸道病原菌，具有时间短、操作简单、特异度和敏感度高等优势，该方法具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力[12-13]。

本研究显示，LAMP芯片法检测下呼吸道感染病原菌的阳性率高于痰培养法(77.61%vs.65.67%)，差异有统计学意义(P<0.05)，因此LAMP芯片法能快速确定感染病原体，医生可根据检测结果正确选择抗菌药物，使患者得到及时有效治疗，大大缩短患者感染急性期及住院时间，减少细菌耐药性的产生。2种方法检测病原菌具有一致性，对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、结核分枝杆菌检测的检测具有一致性，而对耐甲氧西林葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的检测不具有一致性，与以往文献[14]报道基本一致，分析原因可能是LAMP芯片法检测病原菌的灵敏度更高，而痰培养法检测耐甲氧西林葡萄球菌和金黄色葡萄球菌容易受标本污染或实验室检测条件的限制，漏检部分病原菌，因此LAMP芯片法检测的病原菌更能真实地反映下呼吸道感染疾病。研究发现LAMP芯片法对嗜麦芽窄食单胞菌检出率较高，分析原因可能是该方法学检测的灵敏度更高，能从微量核酸中扩增出所需的目的基因[15]。同时，本研究的研究对象是重症监护患者，或与患者合并肺部感染、不规范使用抗菌药物、长期使用糖皮质激素、使用免疫抑制剂和机械通气时间≥7 d等原因有关[16]。

本院重症监护病房患者下呼吸道感染病原菌检出的致病菌以G-菌为主(74.56%)，其中阳性率最高的是鲍曼不动杆菌(20.18%)，其次是肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌(19.30%和13.16%)，均为重要的医院致病菌，这与以往检测结果一致[17-21]。分析原因可能是重症监护病房环境特殊，患者本身基础疾病多，常有生理功能紊乱，免疫功能下降，有创诊疗率高于普通病房，大量广谱抗菌药物及免疫抑制剂的应用等。鲍曼不动杆菌检出率居首位，该菌是医院感染的重要病原菌。免疫力较差的住院患者和严重的呼吸道疾病患者易发生多重耐药鲍曼不动杆菌感染[17-19]，严重威胁患者生命。铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌检出率仅次于鲍曼不动杆菌，可能是因为重症监护病房患者免疫力低、基础疾病多以及长期使用抗菌药物，导致感染铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌风险较高[20-21]。G+菌检出率最高的是耐甲氧西林葡萄球菌，该菌具有多重耐药性，是获得性肺炎的重要致病菌[22-23]。

综上所述，痰培养法虽然价格低廉，可区分定植菌和致病菌，能分辨优势菌株，并且能有针对性地进行药敏试验，但检测周期长，阳性率较低，难以培养非典型病原菌。而LAMP芯片法检测下呼吸道感染病原菌虽然缺乏药物敏感性的检测结果，但检测周期短、灵敏度高，而且可检测非典型病原菌如嗜肺军团菌、结核分枝杆菌，是诊断下呼吸道感染更为快速、简便、灵敏的方法，LAMP芯片法作为新技术，更有利于感染的早期干预，其检测结果可用于指导临床用药。