蜂王幼虫冻干粉对PCPA失眠小鼠的改善作用

唐启河，廖世群，王佳炫，萧杨，陈奕霏，曹喆，田文礼，郭军*

（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

在临床中，失眠是最常见的疾病之一，也是最常见的睡眠障碍[1]。全球的睡眠调查显示，约有4%～22%的欧洲人、18%～23%的日本人、33%的美国人和42.5%的中国人受失眠困扰[2]。对狗、老鼠、蟑螂和苍蝇等动物模型的失眠研究表明，睡眠不足可能导致这些生物过早死亡；大量的临床和试验研究都将睡眠不足与认知功能损伤、胃肠道、免疫、代谢和循环系统功能障碍等健康问题联系在一起[3]。此外，失眠也是焦虑、抑郁、精神分裂症和自杀等精神疾病的早期临床指标[4]。因此，有效地预防和治疗失眠是当今全球的研究热点之一[5]。目前临床使用的抗失眠药物主要为化学合成的西药，如苯二氮卓类受体激动剂[1]。然而，西药的治疗效果并不令人满意，这些药物随着时间的推移还会产生副作用、依赖性和耐受性[1，6]。因此，近年来，研究人员开始从天然的材料中寻找具有治疗失眠作用的物质，如由黄连和肉桂两种中药组成的制剂——交泰丸对失眠具有显著的治疗作用[1]。但现在报道的具有治疗失眠作用的天然物质都集中在中药等植物类物质[1-2，6]，而对于其它的天然物质还鲜有报道。

蜂王幼虫，又称蜂王胎，是蜜蜂的受精卵孵化后取食新鲜的蜂王浆发育而成的[7]，是蜂王浆生产过程中的副产品[8]，也是一种重要的天然蜂产品。我国作为世界第一的养蜂大国，蜂王幼虫的年产量可达600 t左右[9]。相关研究发现，蜂王幼虫含有丰富的必需氨基酸和蛋白质，其中粗蛋白含量占其干重的50%～60%左右，蛋白质含量高于蜂王浆，且其还含有多种维生素和生物活性酶等成分[8，10]。随着对蜂王幼虫产品的不断开发，逐渐地发现蜂王幼虫具有提高免疫力[7-8]、抗氧化[11]、延缓衰老[12]和抗疲劳[13]等保健功效。研究发现免疫系统失调会影响睡眠质量[14]，蜂王幼虫是否会通过增强免疫力来治疗失眠小鼠的睡眠作用还未见报道，因此本研究通过对氯苯丙氨酸（p-chlorophenylalanine，PCPA）构建失眠小鼠模型，探究饲喂蜂王幼虫冻干粉制剂对失眠小鼠的治疗效果，以期寻找到可治疗失眠的天然无副作用的新型抗失眠产品，为进一步将蜂产品往功能食品方向研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

小鼠：昆明医科大学。昆明种雄性小鼠30只，SPF级，体重（20±2）g，将其饲养于昆明理工大学生命科学与技术学院动物房内，环境温度为室温（25±2）℃，相对湿度为55%～65%，分笼饲养，正常采光。小鼠适应饲养7 d，期间自由摄食与饮水，水源为纯净水，饲料为实验鼠维持饲料。

1.1.2 材料与仪器

蜂王幼虫冻干粉：云南老滇凰食品有限公司；实验鼠维持饲料：江苏省协同医药生物工程有限责任公司；小鼠 5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶联免疫吸附测定试剂盒：江苏晶美生物科技有限公司；生理盐水、PCPA：上海源叶生物科技有限公司。

ES2000-2电子天平：沈阳德克天平有限公司；RT-6500酶标仪：上海雨辰生物技术有限公司；JK23116小鼠灌胃针：北京精凯达有限公司。

PCPA注射液：称取PCPA粉末适量，用弱碱性的生理盐水（pH 7～8）配成质量浓度为50 mg/mL的混悬液。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠分组及处置

小鼠适应饲养7 d后，在第8天将小鼠随机分成空白对照组、失眠模型组、低剂量蜂王幼虫冻干粉给药治疗组（0.1 g/kg）、中剂量蜂王幼虫冻干粉给药治疗组（1g/kg）和高剂量蜂王幼虫冻干粉给药治疗组（10g/kg），每组6只。连续2 d对失眠模型组和蜂王幼虫冻干粉给药治疗组小鼠腹腔注射PCPA[400 mg/（kg·d）]，空白对照组小鼠平行注射等体积的弱碱性生理盐水。在最后一次腹腔注射PCPA混悬液24 h后，对小鼠的活动进行监测，以寻找建立失眠模型成功的证据，失眠模型包括昼夜节律丧失、兴奋性增强、攻击性增强、尿和粪便的产生增多、毛发散乱和暗沉以及粪便灰白色，模型建立前后用电子天平给小鼠称重[4]。此外，通过检测小鼠血清中5-HT含量来判断造模是否成功，造模小鼠的血清中5-HT的相对体重含量显著低于空白对照组，则造模小鼠被视为失眠小鼠[6]。造模成功后，每日上午9点～10点进行灌胃给药治疗，空白对照组和失眠模型组灌胃等量去离子水，连续处理7 d，每天灌胃处理后将小鼠放回笼内，笼内放置鼠粮和水，保证各组小鼠能正常自由饮食。

1.2.2 样品采集及处理

治疗7 d后采用断头法处死小鼠，在4℃环境下立即将每只小鼠的心脏、肝、脾、肺及肾等进行解剖并称重，计算出小鼠体重和脏器系数[15]。收集小鼠血清并保存在-80℃备用，将收集到的小鼠血清按试剂盒说明书进行操作，测定小鼠血清中5-HT含量，计算出血清中5-HT的相对体重含量，其中血清中5-HT的相对体重含量/[pg/（mL·g）]=血清中5-HT含量（pg/mL）/小鼠体重（g）。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism 8.3.0和SPSS Statistics 18软件对数据进行差异性分析和作图，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 失眠模型的验证

造模后小鼠血清中5-HT的相对体重含量见图1。

图1 造模后小鼠血清中5-HT的相对体重含量Fig.1 Relative body weight content of 5-HT in serum of mice after modeling

如图1所示，与空白对照组相比，其余4组造模小鼠血清中5-HT的相对体重含量明显下降（P＜0.05）；在连续2 d造模后，与正常小鼠相比，4组造模小鼠的体重也都明显下降。此外，造模后通过对小鼠行为学观察，发现造模小鼠集中表现为攻击性增强、毛发粗糙暗沉、警惕性变高、尿液和粪便增多、昼夜节律消失等症状，符合失眠模型的行为特征。从以上结果可以得知本研究中失眠小鼠模型构建成功。

2.2 蜂王幼虫冻干粉对失眠小鼠的治疗效果

2.2.1 行为学指标检测

不同饲喂条件下小鼠体重变化见图2。

图2 不同饲喂条件下小鼠体重变化Fig.2 Body weight changes of mice under different feeding conditions

如图2所示，第1天～第2天为造模处理时期，第3天造模处理结束，同时从第3天起开始饲喂蜂王幼虫冻干粉，从图2可以看出，由于造模处理，小鼠在最初3 d体重急剧下降，从第4天起，在饲喂治疗7 d内，所有饲喂蜂王幼虫冻干粉组小鼠的体重均开始平稳增长，只有空白对照组体重一直保持增长，未出现体重下降的现象。此外，行为学观察表明，小鼠在治疗期间，攻击性明显减弱、皮毛逐渐洁净、白天睡眠增多、不易惊醒，相对于失眠模型组尿量减少，大便正常，昼夜节律恢复，睡眠时间也相应增加。

2.2.2 蜂王幼虫冻干粉治疗后血清中5-HT的相对体重含量测定

蜂王幼虫冻干粉治疗后小鼠血清中5-HT的相对体重含量见图3。

图3 小鼠血清中5-HT的相对体重含量Fig.3 Relative body weight content of 5-HT in mouse serum

如图3所示，与空白对照组相比，高、中、低剂量蜂王幼虫冻干粉治疗组小鼠血清中5-HT的相对体重含量无明显差异，表明经蜂王幼虫冻干粉治疗后可有效改善失眠小鼠的睡眠；而失眠模型组的小鼠血清中的5-HT相对体重含量与空白对照组相比呈显著降低（P＜0.05），这一结果也充分表明失眠模型构建成功。蜂王幼虫冻干粉灌胃7 d小鼠血清中5-HT的相对体重含量见表1。

表1 蜂王幼虫冻干粉灌胃7 d小鼠血清中5-HT的相对体重含量Table 1 Relative body weight content of 5-HT in serum of mice after intragastric admiistration of lyophilized powder of queen bee larvae for 7 days

从表1可以看出，高、中、低剂量蜂王幼虫冻干粉治疗组与失眠模型组的小鼠相比，血清中的5-HT相对体重含量明显增高（P＜0.05），充分说明蜂王幼虫冻干粉对PCPA失眠小鼠有治疗失眠的效果。

2.2.3 蜂王幼虫冻干粉治疗对小鼠五脏的影响

蜂王幼虫冻干粉对失眠小鼠治疗7 d后，小鼠的体重和器官系数，如表2所示。

表2 蜂王幼虫冻干粉灌胃7 d后的小鼠脏器系数Table 2 Viscera coefficient of mice fed freeze-dried powder to queen bee larvae for 7 days mg/g

由表2可知，与空白对照组相比，3个治疗组的肺和肾的脏器系数并无显著差异；失眠会造成心脏和肝器官的变重，而灌胃蜂王幼虫冻干粉可使这两个器官的质量趋于正常，尤其是灌胃高剂量蜂王幼虫冻干粉的小鼠，心脏和肝器官质量降低更加显著（P＜0.05）；与失眠模型组相比，灌胃高剂量的蜂王幼虫冻干粉会造成小鼠脾脏器官的质量显著增加（P＜0.05）。

3 讨论与结论

PCPA被广泛应用于失眠动物模型的建立，它是5-HT生物合成中的起始酶和限速酶—色氨酸羟化酶的选择性和不可逆抑制剂，其会通过抑制色氨酸羟基化而阻断5-HT的合成，可显著降低脑内和外周血中的5-HT含量[16-17]。而5-HT在睡眠-觉醒调节中发挥着关键作用，5-HT含量降低会造成动物失眠[18]。在本实验中，对小鼠连续2 d注射PCPA进行失眠模型的建立，通过对血清中5-HT的检测，发现注射过PCPA组的小鼠血清中5-HT的相对体重含量都显著低于空白对照组的小鼠，说明本次实验中失眠小鼠模型构建成功。此外，通过对小鼠行为的检测，也证实小鼠失眠模型建立成功。相关研究发现，PCPA注射后，5-HT含量至少在1周内都会保持较低水平[19]。因此，本实验通过对失眠模型小鼠连续7 d灌胃高、中、低剂量的蜂王幼虫冻干粉，进一步观察蜂王幼虫冻干粉对失眠的治疗和改善效果。研究也表明，失眠模型组小鼠的血清中5-HT相对体重含量与空白对照组相比差异显著（P＜0.05），而治疗后的小鼠血清中的5-HT的相对体重含量与失眠模型组相比明显升高（P＜0.05），且3组灌胃治疗组的小鼠的血清中5-HT的相对体重含量与空白对照组中小鼠已无明显差异，这些结果充分说明蜂王幼虫冻干粉对失眠小鼠具有明显的改善作用。

实验中PCPA造模的失眠小鼠其心脏和肝脏质量出现了明显增加，而饲喂蜂王幼虫冻干粉治疗后会减轻这两个器官增加的质量，尤其是高剂量蜂王幼虫冻干粉治疗的小鼠心脏和肝脏质量与失眠模型组的小鼠出现了显著降低（P＜0.05），而与空白对照组已无明显差异，表明蜂王幼虫冻干粉对失眠带给小鼠器官的负面影响具有改善作用。在一项对失眠人群的研究中发现失眠会导致患非酒精性脂肪肝的风险增加[20]，而非酒精性脂肪肝通常表现为肝脏脂肪积累增多变重[21]，因此，失眠模型小鼠肝脏质量增加可能是患非酒精性脂肪肝的前兆。在对失眠小鼠饲喂高剂量蜂王幼虫冻干粉后，其脾脏与其它组小鼠相比明显变重，而脾脏是重要的免疫器官，在免疫应答方面起着重要作用[22]。这说明高剂量蜂王幼虫还会提高小鼠的免疫力，这与周瑞华等[7]的研究结果相一致。蜂王幼虫在整个生命阶段都会一直取食蜂王浆[23]，因此，本研究中饲喂失眠小鼠的蜂王幼虫冻干粉中也含有蜂王浆的一些营养成分，最近有研究发现，蜂王浆中的王浆主蛋白具有改善免疫的作用[24]，蜂王幼虫能增强小鼠免疫力很可能是王浆主蛋白发挥了重要作用。

免疫系统对睡眠有着重要的调节作用[14]，研究发现一些免疫细胞因子、褪黑素和生长激素等都参与了睡眠调节，若免疫系统功能发生失调，这些细胞因子等就会发生失调，从而引起睡眠障碍[22，25-26]。蜂王幼虫冻干粉中除了含有可增强免疫力的王浆主蛋白，还含有蜂蛹多肽等肽类物质，研究发现蜂蛹多肽可增强RAW264.7巨噬细胞的免疫活性[27]，因此，蜂王幼虫可改善失眠小鼠的睡眠作用，很可能是通过蜂王幼虫冻干粉中的活性蛋白（如王浆主蛋白）和蜂蛹多肽等肽类物质的综合作用提高和改善了小鼠的免疫力，从而达到治疗失眠的作用。另外，相关研究发现肠道微生物受到睡眠质量影响，睡眠不足会改变肠道正常菌群[28]，而通过调节失眠小鼠肠道菌群的结构和组成，来增加肠道菌群中有益菌群的比例，可有效改善小鼠的睡眠作用[29]，蜂王幼虫冻干粉可能也会通过改变失眠小鼠的肠道菌群来改善睡眠作用，但还需要进一步实验来验证。

综上所述，本研究发现蜂王幼虫具有改善PCPA失眠小鼠的作用，蜂王幼虫冻干粉改善失眠小鼠的睡眠作用可能是通过提高小鼠免疫力等机制来实现的，但蜂王幼虫冻干粉改善失眠小鼠的具体机制还需要进一步深入研究。