橘子不同部位活性成分含量及其体外抗氧化能力研究

刘仙俊，李文华*，孙红艳，尤金美，张红阳，张天宇，郝春燕，卫乐

（1.太原科技大学化学与生物工程学院，山西 太原 030024；2.山东省临沂市第十八中学，山东 临沂 276000）

橘子，芸香科柑橘属（Citrus reticulata Blanco）植物[1]，不仅具有丰富的营养价值更具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎、保护神经、预防糖尿病和心血管疾病等重要的医学价值[2-3]。橘肉香气清爽，口感酸甜，富含营养成分，是人们的常食部位，橘皮、橘络具有化痰止咳、健脾和胃、顺气活血的功效，经常入药使用[3-5]。橘子各部位的营养价值和其富含多酚类、黄酮类、多糖、矿物质、维生素等生物活性物质是分不开的[2，6-10]，这些天然活性物质大多具有抗氧化的作用，能够清除人体内多余的自由基，使机体免受活性氧自由基伤害而导致的蛋白质和核酸受损、酶失活、脂质过氧化等不良后果[11-21]。目前对橘子生物活性物质的研究主要集中在橘皮，孙红彦[3]研究表明橘子皮提取物可以保护机体免疫器官、提高机体免疫水平、抑制体内实体瘤的生长从而实现抗肿瘤作用；刘存芳等[5]研究发现橘皮多糖对羟基自由基具有较强的清除作用且存在一定量效关系，但对橘皮、橘肉和橘络的生物活性成分含量及其抗氧化性的比较研究很少有报道。

本文以橘皮、橘肉、橘络作为研究对象，分别对其总酚、总黄酮和多糖含量及体外抗氧化性能进行检测和比较分析，旨在为橘皮、橘肉、橘络的深加工提供充足的参考依据，为橘子各部位相关产品在抗氧化功效方面的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橘子：市售，临海涌泉蜜橘，新鲜优质且无坏果。

没食子酸、芦丁、葡萄糖（均为色谱纯）：美国Sigma公司；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（均为色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、七水硫酸亚铁（均为分析纯）：上海生工生物工程股份有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水碳酸钠、正丁醇、乙醚、氯仿、抗坏血酸、水杨酸、浓盐酸、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

台式离心机（D-37520型）：德国赛默飞世尔科技公司；紫外可见分光光度计（UV-5200型）：上海元析仪器有限公司；高速万能粉碎机（FW-200型）、电热恒温水浴锅（HH-2A型）：北京科伟永兴仪器有限公司；电子分析天平（FA1004型）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；酸度计（PHS-3C型）：上海佑科仪器仪表有限公司；真空冷冻干燥箱（Pilot5-8M型）：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理及样品溶液制备

将橘子去灰洗净，分离出橘皮、橘肉、橘络，分别切碎后摆在冻干盘内真空冷冻干燥，粉碎后过筛（60目）备用。称取2 g冻干粉末样品，加入70%的乙醇溶液，使料液比达到 1∶10(g/mL)，60℃下，以 250 r/min振荡2 h后，7 000 r/min离心10 min，缓慢吸取上清液，剩余残渣在同等条件下再提一次，两次上清液合并且定容备用，所有试验重复3次。

1.3.2 测定橘子不同部位的总酚含量

1.3.2.1 绘制没食子酸标准曲线

没食子酸标准曲线见图1，得到具有良好线性关系的回归方程：Y=106.25X+0.0243，回归系数R2=0.9909（X为没食子酸标液浓度，mg/mL；Y为吸光度）[22]。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 The standard curve of gallic acid

1.3.2.2 测定总酚含量

取25 mL容量瓶，加入样品溶液1 mL、Na2CO3溶液（质量分数12%）2 mL、福林酚1 mL，定容至刻度，避光反应2 h，测765 nm处吸光度，根据公式（1）计算橘皮、橘肉、橘络的总酚含量。

式中：P为样品总酚含量，mg/g；C为经标准曲线计算得出的反应液总酚浓度，mg/mL；V为反应液体积，mL；N为稀释倍数；M为样品干重，g。

1.3.3 测定橘子不同部位的总黄酮含量

1.3.3.1 绘制芦丁标准曲线

芦丁标准曲线见图2，得到线性关系良好的回归方程：Y=10.602X+0.015 9，回归系数 R2=0.994 9（X 为芦丁标液浓度，mg/mL；Y 为吸光度）[9]。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 The standard curve of rutin

1.3.3.2 测定总黄酮含量

取10 mL容量瓶，加入样品液2.0 mL、70%的乙醇3 mL、质量浓度5%的NaNO2溶液0.3 mL，混匀，静置6 min后，取质量浓度10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL加入其中，混匀，再静置6 min；取4%的NaOH溶液（质量浓度）4 mL加入其中，最后用70%的乙醇定容到10 mL，混匀，12 min静置结束后立即测510 nm处吸光度，根据公式（2）计算橘皮、橘肉、橘络的总黄酮含量。

式中：P为样品总黄酮含量，mg/g；C为经标准曲线计算得出的反应液总黄酮浓度，mg/mL；V为反应液体积，mL；N为稀释倍数；M为样品干重，g。

1.3.4 测定橘子不同部位的多糖含量

1.3.4.1 绘制葡萄糖标准曲线

参照文献[22]，绘制苯酚-硫酸法测样品多糖含量所用的葡萄糖标准曲线，如图3所示。得到线性关系良好的回归方程：Y=73.103X+0.032 1，回归系数R2=0.994（X为葡萄糖浓度，mg/mL；Y为吸光度）。

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 The standard curve of glucose

1.3.4.2 测定多糖含量

准确称取样品冻干粉末300 mg于10 mL离心管，加蒸馏水定容至10 mL，混匀后水浴（85℃）并振荡2 h，8 000 r/min离心10 min，转移上清液至另一洁净离心管，加 10 mL 的 Sevage试剂[正丁醇:氯仿=1∶4（体积比）]，振荡 5 min，8 000 r/min 离心 10 min，将水相转移到3倍体积80%的乙醇中，摇匀，静置2 h后离心15 min（5 000 r/min），所得沉淀干燥即为粗多糖，其用蒸馏水溶解定容到25 mL，吸取1 mL定容液，按参考文献[23]测吸光度，根据公式（3）计算橘皮、橘肉、橘络的多糖含量（以葡萄糖计）。

式中：P为样品多糖含量，mg/g；C为经标准曲线计算得出的反应液多糖浓度，mg/mL；V为反应液体积，mL；N为稀释倍数；M为样品干重，g。

1.3.5 测定DPPH自由基（DPPH·）清除率

取3支洁净试管，分别准确吸取0.5 mL样品溶液（样品组）、抗坏血酸溶液（阳性对照组）和蒸馏水（空白组），然后分别加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL，轻轻混匀后于37℃避光反应30 min，冷却至室温（25℃），测515 nm处吸光度，根据公式（4）计算橘子不同部位的DPPH·清除率。

式中：Ai为样品吸光度；Aj为阳性对照吸光度；A0为空白对照吸光度。

1.3.6 测定超氧阴离子自由基（O2-·）清除率

3支空试管中分别移取0.5 mL样品溶液（样品组）、抗坏血酸溶液（阳性对照组）和蒸馏水（空白组），再分别加入4.0 mL的Tris-HCl缓冲液（0.2 mol/L，pH 8.2），混匀，静置4 min，加入2滴8 mol/L盐酸立即终止反应，测420 nm处吸光度，根据公式（4）计算样品的O2-·清除率。

1.3.7 测定羟基自由基（·OH）清除率

取3支空试管，分别准确移取0.5 mL的样品溶液（样品组）、抗坏血酸溶液（阳性对照组）和蒸馏水（空白组），再分别加入2 mmol/L的水杨酸0.4 mL、6 mmol/L的 H2O2溶液 1 mL、0.15 mmol/L的 FeSO4溶液 1 mL及蒸馏水0.4 mL，混匀，37℃下水浴1 h，冷却至室温（25℃）后于510 nm处测吸光度，根据公式（4）计算样品的·OH清除率。

1.3.8 测定过氧化氢（H2O2）清除率

向3支空试管中各吸取3.4 mL样品溶液（样品组）、抗坏血酸溶液（阳性对照组）和蒸馏水（空白组），再分别加入40 mmol/L的H2O2溶液（用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液配制）0.6 mL，混匀，测230 nm处吸光度，根据公式（4）计算样品H2O2清除率。

1.4 统计分析

试验均重复3次，数值以平均值±标准差表示，采用统计学软件SPSS17.0进行相关性、显著性分析。

2 结果与分析

2.1 橘子不同部位的活性成分含量

分别对橘皮、橘肉、橘络中的总酚、总黄酮和多糖含量进行了测定，结果见表1。

表1 橘子不同部位中活性成分含量Table 1 The contents of active components in different parts of tangerine

如表1所示，橘子不同部位各活性成分含量均存在显著差异（P＜0.05）。橘皮、橘肉、橘络中总酚含量最高的是橘肉，为（10.51±0.36）mg/g，其次是橘皮，橘络总酚含量最低，为（6.38±0.27）mg/g。橘子不同部位的总黄酮含量也有显著差异，在（1.54±0.05）mg/g～（6.13±0.23）mg/g的范围内，其总黄酮含量最高是橘皮，为（6.13±0.23）mg/g，其次是橘肉，橘络总黄酮含量最低。从表1可以看出，橘子不同部位的总黄酮含量都低于其总酚含量，这可能是由于大多数的黄酮类化合物都属于多酚类物质。橘皮、橘肉、橘络中的多糖含量在（18.05±0.24）mg/g～（36.40±0.11）mg/g 的范围内，其中橘皮多糖含量最高，为（36.40±0.11）mg/g，其次是橘肉，橘络多糖含量最低。橘子不同部位的多糖含量都高于其总酚和总黄酮含量，橘皮和橘肉的总酚、总黄酮和多糖含量都高于橘络。

2.2 橘子不同部位抗氧化能力比较

各种抗氧化成分具有不同的抗氧化机理[24-25]，且橘子各部位的活性成分及含量也具有差异，所以需要综合不同的检测方法分析其抗氧化能力，本研究通过对 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2的清除率来分析橘子不同部位的抗氧化能力，具体结果见表2。

表2 橘子不同部位的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rate of different parts in tangerine

由表2可知，橘子不同部位对4种自由基的清除率均存在明显差异，这可能是由于橘子不同部位所含的抗氧化活性成分及含量不同。

DPPH·是一种稳定性较好的自由基，被广泛用于天然活性物质的抗氧化能力研究[26]，由表2可见，橘皮、橘肉、橘络的DPPH·清除率存在显著差异（P＜0.05），其中橘皮DPPH·清除率最高，为（82.99±0.91）%，其次是橘肉和橘络，DPPH·清除率分别为（76.60±0.73）%和（56.90±1.26）%。

O2-·是一种性质活泼的自由基，可致衰老、机体脂质过氧化、细胞损伤，并诱发多种皮肤病、心血管疾病和癌症等[25]，从表2可以看出，橘皮、橘肉、橘络的O2-·清除率也有显著差异（P＜0.05），但相比其它3种自由基的清除率来说相对较低，其中O2-·清除率最高是橘肉，为（58.27±0.98）%，其次是橘皮和橘络，O2-·清除率分别为（49.83±0.82）%和（36.34±0.47）%。

·OH是一种氧化性极强的自由基，具有强大的得电子能力，使其对生物体有强毒害，常导致人体产生各种复杂疾病[25]。如表2所示，橘子不同部位·OH清除率具有一定差异，其中清除率最高的为橘肉，高达（89.83±0.96）%，其次是橘皮和橘络，二者之间的·OH清除率差异不显著（P＞0.05），分别为（70.00±1.62）%和（69.58±1.12）%。

H2O2也是造成人体疾病和衰老的重要原因之一，虽然从结构看并不同于一般自由基，但其对人体的伤害与自由基类似，主要损害人体内生物大分子[25]。由表2可以看出，橘皮、橘肉、橘络的H2O2清除率差异显著（P＜0.05），其中橘皮的H2O2清除率最高，为（69.61±0.75）%，其次是橘肉，H2O2清除率为（63.27±0.45）%，清除率最低的是橘络，为（46.72±0.61）%。

2.3 橘子不同部位活性成分含量与抗氧化能力之间的相关性

通过SPSS 17.0统计软件对橘子不同部位活性成分含量及其 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2清除率之间进行相关性分析，所得各变量间的Pearson相关系数以及显著性（双侧）检验结果如表3所示。

表3 橘子不同部位活性成分含量与其抗氧化活性之间的相关性Table 3 The coefficients among the contents of active components and antioxidant capacity of different parts in tangerine

从表3可以看出，橘子不同部位的总酚、总黄酮和多糖含量之间都呈现正相关，其中多糖含量和总酚、总黄酮含量间的相关性都较高（相关系数分别为0.698和 0.933）；橘子各部位总酚含量与 DPPH·、O2-·、·OH和H2O24种自由基清除率都呈正相关，其中与O2-·清除率相关性显著（P＜0.05，相关系数为0.999）；总黄酮含量与DPPH·、O2-·和H2O23种自由基清除率呈正相关（相关系数分别为0.883、0.438和0.899）；橘子不同部位多糖含量与4种自由基清除率之间也都呈正相关，其中与DPPH·和H2O2清除率相关性较高（相关系数分别为0.993和0.996）；橘子4种自由基清除率之间都呈正相关，其中DPPH·和H2O2清除率相关性显著（P＜0.05，相关系数为 0.999）。

3 结论

橘子不同部位的总酚、总黄酮和多糖含量均存在显著差异（P＜0.05），其中总酚含量以橘肉为最高，为（10.51±0.36）mg/g，橘皮中总黄酮和多糖含量均最高，分别为（6.13±0.23）mg/g 和（36.40±0.11）mg/g，橘子各部位的多糖含量都高于其总酚含量，其总酚含量都高于其总黄酮含量，橘皮和橘肉的总酚、总黄酮和多糖含量都高于橘络。

橘子不同部位清除各种自由基的能力都比较强，但也存在明显差异，其中橘皮对DPPH·和H2O2清除率最高，分别为（82.99±0.91）%和（69.61±0.75）%，橘肉对O2-·和·OH清除率最高，分别为（58.27±0.98）%和（89.83±0.96）%。橘皮和橘肉对4种自由基清除率都高于橘络。

相关性分析表明橘子不同部位的总酚含量、总黄酮含量及多糖含量之间都呈正相关，且橘子总酚含量、多糖含量与4种自由基清除率之间也都呈正相关，其O2-·清除率与总酚含量间呈显著正相关（P＜0.05，相关系数为0.999），总黄酮含量与DPPH·、O2-·和H2O2这3种自由基清除率之间也呈正相关。

总之，橘皮、橘肉和橘络中都含有丰富的多酚、黄酮和多糖类物质，且具有比较强的抗氧化能力，该研究可为橘子不同部位的深加工及天然抗氧化产品的开发提供理论参考。