lncRNA CTD-2066L21.1的表达在胃癌顺铂耐药中的作用

朱洁洁，顾康生

(安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽 合肥 230032)

0 引言

最新全球数据显示，胃癌(GC)是全球第五个最常见的肿瘤和肿瘤患者死亡的第三大原因[1]，是一个危害人类健康的重大疾病。胃癌的治疗方式包括手术、化疗、分子靶向治疗等，尽管胃癌治疗取得了一些进展，很多胃癌患者的生存期得以延长，但大多数胃癌中晚期患者仍预后较差，其中与化疗耐药的产生息息相关。铂类为胃癌化疗的一线药物之一，探究其耐药相关分子标志物，对改善胃癌预后至关重要。近年来国内外已有不少研究证实lncRNAs与胃癌预后相关，且参与了胃癌化疗耐药。本研究前期通过比较胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP与其亲本细胞SGC7901之间lncRNA表达谱的差异，筛选出可能与GC细胞中铂类药物耐药密切相关的lncRNA CTD-2066L21.1，本研究旨在继续探讨其在胃癌铂类耐药细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

总RNA提取试剂TRIZOL购自美国Invitrogen公司；lncRNA 逆转录试剂盒、RT-PCR试剂以及敲低、过表达慢病毒载体均购自上海吉玛制药技术公司；人类胃癌细胞株SGC7901，和人胃黏膜上皮细胞 GES-1，均从中国科学院(上海)细胞库获得；对顺铂耐药的SGC7901/DDP细胞购于南京凯基生物科技发展有限公司；10%胎牛血清、链霉素(100 g/mL)和青霉素(100 U/mL)、RPMI-1640细胞培养基购自美国 Gibco 公司；MTT、DMSO 购自美国 sigma公司；DEPC 水购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 细胞培养

将细胞保存在含10%胎牛血清、链霉素(100g/mL)和青霉素(100U/mL)的RPMI-1640细胞培养基中，放置于37℃、5% CO2的培养箱中。为了维持顺铂耐药表型，将终浓度为800 ng/mL的顺铂加入到SGC7901/DDP细胞的培养基中。实验前将SGC7901/DDP细胞在无顺铂的培养基中培养一周。

1.3 RNA提取及定量

严格按照TRIZOL试剂操作说明提取人GC细胞的总RNA。PBS清洗3次细胞后加入TRIZOL试剂，冰上操作，吹打混悬后转移至1.5mL EP管中，加入氯仿充分振荡，于室温下放置5min后离心，取上清液，加入预冷异丙醇，混匀后再离心，弃上清，加入无水乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥沉淀，加入适量的DEPC水溶解稀释。取少量RNA溶液，用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测其浓度和纯度。当A260/A280比值在1.8～2.0之间时，RNA纯度较好。用DEPC稀释定量RNA。

1.4 RT-PCR 检测

lncRNA的RT-PCR按照RT-qPCR定量试剂盒(Gene Pharma)的说明书进行，合成cDNA 第一链后，将反应体系置于逆转录仪(LightCycler480)上，进行PCR扩增。lncRNA CTD-2066L21.1的表达水平通过2-ΔΔCt表达。ΔCt为同一样本中目的基因与内参基因(β-actin) Ct 值的差值。

1.5 慢病毒转染

将对数生长期的细胞接种在12孔板的培养板中，当细胞汇合度30%-50%时，除去旧培养基，继续接种在不含血清及双抗的培养基，将构建好的敲低或过表达lncRNA CTD-2066L21.1慢病毒载体(含有目的片段、GFP 荧光标记、抗嘌呤霉素耐药基因)，加入培养孔中。24 h 后，吸去孔中含有慢病毒的培养基，加入新鲜完全培养基进行细胞培养。72 h 后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白 GFP 的表达，评估转染效率。利用嘌呤霉素筛选转染的细胞以获得纯种的转染细胞，RTPCR法验证细胞目的基因过表达或敲低的效率；培养、传代、保种，进行后续实验。

1.6 细胞活性分析

将SGC7901/DDP细胞接种于96孔板上。24h后，顺铂浓度分别为40、20、2、0.2、0.02和0.002μg/mL处理SGC7901/DDP细胞48h。20μl MTT (5 mg/mL；SIGMA)被加入每个槽中。孵育4 h后，加入150μl二甲基亚砜(SIGMA)，轻轻摇匀10min。测定490 nm处的吸光度。利用SPSS 19.0软件根据细胞活性计算顺铂的半抑制浓度(IC50)。所有操作至少重复三次，结果取平均值。

1.7 流氏细胞仪分析

采用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(BestBio)，通过流式细胞术(FCM)检测SGC7901/DDP和SGC7901细胞的凋亡率。对SGC7901/DDP细胞和SGC7901细胞(～1×106细胞)分别用终浓度为0.8和0.3 g/mL的顺铂处理。在37℃下处理48h后，收集细胞并用冰PBS洗涤两次。用400 μL的1×结合缓冲液重悬细胞，密度最终维持在1×106个细胞/mL左右。加入5μL膜联蛋白V-FITC，室温避光下孵育15 min。然后在悬液中加入10μL PI，在室温黑暗下孵育5min。最后，使用Gallios流式细胞仪检测细胞凋亡情况(早期+晚期)。

1.8 统计学分析

数据采用SPSS 19.0软件进行分析。采用t检验(两组)或单因素方差分析(ANOVA，超过两组)来确定变量之间的差异。P值<0.05时认为差异有统计学意义。使用Graphpad软件8.0绘制相关图表。

2 结果

2.1 lncRNA CTD-2066L21.1 在 SGC7901/DDP 细胞中明显上调

本课题组前期将胃癌细胞株和胃癌耐药细胞株中利用博奥晶芯 LncRNA+mRNA Human Gene Expression Microarray V4.0，4×180K 芯片进行检测分析，发现在胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP中下调的有223种，上调的有187种，这其中就包括上调的p13641(CTD-2066L21.1)(P<0.05，差异倍数≥2)。之后我们进行RT-PCR法检测，lncRNA CTD-2066L21.1在胃癌耐药细胞株 SGC7901/DDP中的表达显著高于胃癌亲本细胞株 SGC7901，差异有统计学意义(P<0.001)，与芯片检测结果一致。因此，我们猜测lncRNA CTD-2066L21.1与胃癌顺铂耐药有关。

图1 lncRNA CTD-2066L21.1 在 SGC7901/DDP 细胞中明显上调。

2.2 慢病毒转染

为了进一步探讨lncRNA CTD-2066L21.1与胃癌顺铂耐药之间的关系，本研究通过重组慢病毒过表达载体CTD-2066L21.1-mimic，转染原本低表达的SGC7901细胞，用CTD-2066L21.1-siRNA下调SGC7901/DDP细胞中的CTD-2066L21.1表达，之后用嘌呤霉素筛选、RT-PCR验证，构建稳定过表达和低表达细胞株。如图2A所示，RT-PCR结果示转染后的SGC7901细胞(SGC7901-CTD-2066L21.1-OE)CTD-2066L21.1表达量显著高于普通未转染的胃癌亲本对照细胞(SGC7901)和对照载体(SGC7901-NC)(P<0.001)，说明过表达细胞株构建成功；用CTD-2066L21.1-siRNA转染三种SGC7901/DDP细胞，发现与SGC7901/DDP-CTD-184，和SGC7901/DDP-CTD-254相比，转染后的分析结果显示SGC7901/DDP-CTD-121敲除效率最佳(图2B，P<0.01)，因此后续选择SGC7901/DDPCTD-121继续接下来的研究。

图2 建立稳定细胞株

2.3 细胞活力检测

接下来我们通过细胞活力检测研究过表达CTD-2066L21.1对SGC7901/DDP细胞顺铂耐药性的影响。在体外分别以不同浓度的顺铂处理各组SGC7901/DDP细胞，48h后检测细胞活力。结果显示：过表达CTD-2066L21.1后，SGC7901细胞的活力明显增强；过表达组的半数抑制浓度(IC50)显著高于阴性对照组(SGC7901-NC)和空白对照组(SGC7901)(图3A，P<0.01)，差异有统计学意义。而在胃癌耐药细胞中，敲除CTD-2066L21.1后，SGC7901/DDP-CTD-KD 细胞对顺铂敏感性增加；过表达组的半数抑制浓度(IC50)显著低于阴性对照组(SGC7901/DDP-NC)和空白对照组(SGC7901/DDP)(图3B，P<0.01)，以上结果表明，CTD-2066L21.1的上调可降低胃癌细胞对顺铂的敏感性，其下调能逆转胃癌顺铂耐药细胞对顺铂的耐药性。

图3 (A)上调lncRNA CTD-2066L21.1可降低SGC7901细胞对顺铂的敏感性；P<0.01。(B)敲除lncRNA CTD-2066L21.1逆转了SGC7901/DDP细胞中的顺铂耐药；P<0.01。

2.4 流式细胞仪分析

为了进一步验证，用流式细胞仪分析显示SGC7901细胞和SGC7901/DDP在顺铂治疗48h后(最终浓度为1μg/mL)的凋亡率。结果与细胞活力实验结果一致，敲除lncRNA CTD-2066L21.1后的SGC7901/DDP细胞对DDP诱导的凋亡敏感性增加，凋亡率升高(P<0.001)；而上调lncRNA CTD-2066L21.1使SGC7901细胞顺铂诱导的凋亡细胞率减少，耐药性增加(P<0.001)。

图4 (A) 敲除lncRNA CTD-2066L21.1使SGC7901/DDP细胞对DDP诱导的凋亡敏感；P<0.001。(B) lncRNA CTD-2066L21.1上调使SGC7901细胞顺铂诱导的凋亡减少；P<0.001。

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，居我国常见恶性肿瘤发病率第2位和死亡率第3位，是一个重大的公共卫生问题。早期胃癌治疗的首选的主要方式是根治性手术切除，但对于中晚期癌症患者，手术不能完全切除病变。化疗是人类胃癌术后的主要治疗策略，它可以一定程度上延长患者生存期、改善预后。然而化疗耐药的产生极大地影响了疗效。探究其分子标志物，同时寻找化疗耐药分子靶标成为研究热点。

lncRNAs是一种长度大于200个核苷酸但缺乏蛋白编码能力的长链非编码RNA[2]。lncRNAs在哺乳动物中主要由RNA聚合酶(RNAP) II或III转录，在植物中主要由RNAP IV和V转录[3,4]。由于高通量RNA测序(RNA-seq)方法的广泛应用，在哺乳动物和植物等许多生物体内发现了成千上万的lncRNAs。lncRNAs的功能包括基因印记、组蛋白修饰、染色质重构、转录激活、转录干扰、核转运、调节细胞周期等[5-9]。

近年来国内外已有不少研究证实lncRNAs在胃癌中广泛表达，并影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及对化疗的疗效。MORIDI H[10]研究发现lncRNA NONHSAT062994在GC样本组织中表达下调，并与组织学分级和肿瘤大小显著相关，与年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移、血管转移和坏死无关。Hongbing Zhai[11]发现胃癌组织和细胞系中lncRNA BCYRN1-27表达显著升高，其中29例胃癌患者BCYRN1 - 27表达与肿瘤深度、淋巴结转移及临床分期呈正相关，单因素和多因素Cox回归分析显示，高BCYRN1- 27表达是胃癌患者生存的独立预后因素。Wang L[12]在细胞学实验中发现lncRNA 4(BCAR4)在顺铂耐药细胞株(SGC7901/DDP)中的表达增强；BCAR4在SGC7901细胞中的过度表达增加了对顺铂的耐药性，而降低BCAR4在SGC7901/DDP细胞中的表达，会提高对顺铂的敏感性。

CTD-2066L21.1 是一种基因间长链非编码 RNA，它是已知的新型 RNA，目前功能尚不明确。关于lncRNA CTD-2066L21.1在胃癌中的表达及其与细胞耐药的影响，相关文献报道非常少。本课题组前期通过芯片检测分析发现相比较普通胃癌细胞株，CTD-2066L21.1在胃癌耐药细胞株 SGC7901/DDP 中明显上调，由此我们推测CTD-2066L21.1 可能与胃癌细胞顺铂耐药性有着密切的关联。RT-PCR结果证实lncRNA CTD-2066L21.1在SGC7901/DDP中的表达显著高于SGC7901，后通过重组慢病毒载体转染，在SGC7901中过表达lncRNA CTD-2066L21.1，细胞对顺铂耐药性增强，凋亡率降低。而在SGC7901/DDP细胞中敲低lncRNA CTD-2066L21.1表达后，细胞的活性降低，凋亡率升高。因此，lncRNA CTD-2066L21.1的表达与胃癌顺铂耐药相关，可能成为胃癌铂类耐药潜在的分子标志物。

4 结论

lncRNA CTD-2066L21.1上调可使胃癌细胞对顺铂敏感性降低，其下调可逆转SGC7901/DDP细胞的顺铂耐药性。