小麦矮秆基因 Rht-B1b和 Rht-D1b的检测及其验证

刘 娟，张 凯，范胜男，韩 洋，冯玉梅，李星岩，韩 冰，杨 燕

(内蒙古农业大学生命科学学院植物生物技术功能实验室/内蒙古自治区植物逆境生理与分子生物学重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018)

小麦作为全球主要的粮食作物之一[1]，随着全球人口数量不断增加、气候不断恶化以及旱涝等自然灾害频发，使得小麦产量大幅度下降。因此，高产成为小麦育种的主要目标之一。株高作为谷类作物的重要农艺性状，对作物产量潜力和稳定性具有重要影响。研究表明，降低株高可提高植物的抗倒伏性[2-3]。

上世纪60年代，矮秆基因首次应用到小麦育种中，引发了第一次“绿色革命”[4]，在小麦育种实践中利用的矮秆基因大体可分为三类：草丛型矮生基因(D)、单茎矮生基因(Us)[5-6]和降低株高的主效矮秆基因(Rht)。截止目前，已发现的小麦Rht矮秆基因共有25个，每个Rht基因对小麦株高产生的影响不同。其中，在小麦的矮化育种中，使用最广泛的矮秆基因是来自于农林10号的Rht-B1b(Rht1基因突变型)、Rht-D1b(Rht2基因突变型)和来自于日本赤小麦(Akakomugi)的Rht8[7-8]。Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8为隐性基因，分别位于小麦4B、4D和2D染色体上。研究发现，Rht-B1b和Rht-D1b基因单独存在时，降秆效应约24%，Rht-B1b和Rht-D1b同时存在时，会产生累加作用，降秆效应近60%[9-10]。而Rht8降秆效应为11%[11]，相较于Rht-B1b和Rht-D1b，降秆能力较弱[12]。

分子标记的应用，使得更多的基因被准确定位，Ellis等[13]设计的STS分子标记可以准确地鉴定出Rht-B1b和Rht-D1b基因。本研究利用Ellis等[13]设计的STS分子标记引物对321份中国小麦材料Rht-B1b和Rht-D1b基因的分布情况进行检测，此外，对91份春小麦育种材料(具有株高表型数据)中Rht-B1b、Rht-D1b以及Rht-B1b+Rht-D1b的分布及各单倍型对小麦株高的影响进行分析，以期筛选出优良的矮秆基因资源，为合理利用小麦资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料包括321份小麦材料，其中，中国冬麦区白粒小麦品种84份，中国小麦历史品种106份，春小麦育种材料131份，均由本实验室收集和保存。并选取91份春小麦育种材料(具有株高表型数据)进行春小麦自然群体的株高鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦基因组DNA提取

利用CTAB法[14]提取321份小麦幼嫩叶片的基因组DNA，利用紫外分光光度计检测DNA浓度，并将终浓度调至50 ng·μL-1，存于-20 ℃备用。

1.2.2 矮秆基因的分子标记检测

根据Ellis等[13]发表的序列设计引物，引物对BF/WR1用于扩增Rht-B1a基因(Rht1基因野生型)，引物对BF/MR1用于扩增Rht-B1b基因(Rht1基因突变型)；引物对DF2/WR2用于扩增Rht-D1a(Rht2基因野生型)，引物对DF1/MR2用于扩增Rht-D1b(Rht2基因突变型)，分别以小偃 6 号(含有Rht-B1b基因)[15]和新麦18(含有Rht-D1b基因)[16]为阳性对照，验证PCR反应和电泳结果的准确性。上述引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成，具体序列信息见表1。

PCR反应体系为15 μL，包括模板DNA 1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 6.2 μL，引物(浓度为0.25 nmol·μL-1)各0.15 μL，灭菌双蒸水补充至15 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性30 s，退火温度见表1，时间为 30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用Gold View核酸染料染色，缓冲体系为1×TAE溶液，100 V电压下电泳20 min，在凝胶成像仪下观察并照相。

表1 扩增矮秆基因所用的特异引物Table 1 Specific primers for amplification of dwarfing genes

1.2.3 91份春小麦育种材料株高的测定

2015和2016年分别将91份春小麦育种材料播种于内蒙古呼和浩特市，采用随机区组设计，行长2 m，株距15 cm，行距20 cm，设置2个重复，在相同外界条件下进行培养，小麦进入成熟期后，每一株系随机选取10个单株进行株高测量，统计每份材料两年的平均株高数据，求均值。

2 结果与分析

2.1 Rht-B1基因位点等位变异的分布频率

利用两对引物BF/MR1和BF/WR1对供试材料Rht-B1基因位点进行PCR检测，结果(图1，表2～4)显示，在321份材料中，中国春、河套3号等66份材料含有矮秆基因Rht-B1a，占总数的20.1%；82170-1、临优一号等193份小麦品种含有矮秆基因Rht-B1b，占总数的 60.1%；巴丰5号、兰天25号等62份材料不含所检测矮秆基因，占总数的19.3%。

在84份中国冬麦区白粒小麦品种中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所检测矮秆基因的材料分别有30、29和25份，占比分别为35.7%、34.5%和29.8%。在106份历史小麦品种中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所检测矮秆基因材料分别有8、77和21份，占比分别为7.6%、72.6%和19.8%。在131份春小麦育种材料中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所检测矮秆基因的材料分别有28、87和16份，占比分别为 21.4%、66.4%和12.2%。

2.2 Rht-D1基因位点等位变异的分布频率

对供试小麦品种Rht-D1基因位点进行PCR检测，结果(图2，表2～4)显示，321份材料中，永2352、临农14等73份小麦品种含有矮秆基因Rht-D1a，占总数的22.7%；临优一号、格兰尼等135份小麦品种矮秆基因Rht-D1b，占总数的42.1%；沈太1号、陕农757等113份小麦品种均不含所检测矮秆基因，占总数的35.2%。

表2 84份中国冬麦区白粒小麦品种矮秆基因的检测Table 2 Detection result of dwarfing genes in 84 wheat cultivars in China winter wheat areas

+代表有该材料含有所检测的矮秆基因；-代表该材料不含所检测的矮秆基因。表3～4同。

+ means containing the dwarfing genes detected;-means not containing dwarfing genes detected.The same in tables 3-4.

表3 106份中国历史小麦品种矮秆基因的检测结果Table 3 Detection result of dwarfing genes in 106 historical wheat cultivars

表4 131份春小麦材料矮秆基因的检测结果Table 4 Detection result of dwarfing genes in 131 spring wheat breeding materials

(续表4 Continued table 4)

在84份中国冬麦区白粒小麦品种中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含所检测矮秆基因的材料分别有14、41和29份，占比分别为16.7%、48.8%和34.5%。在106份历史小麦品种中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含Rht-D1a和Rht-D1b矮秆基因的材料分别有40、21和45份，占比分别为37.7%、19.8%和42.5%。在131份春小麦育种材料中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含所检测矮秆基因的材料分别有19、73和39份，占比分别为14.5%、55.7%和29.8%。

2.3 不同基因型材料的株高结果

选取91份春小麦育种材料，对其株高及其相关基因进行分析，结果(表5)发现，含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1b+Rht-D1b以及不含所检测矮秆基因小麦材料的平均株高分别为 71.95、67.84、67.19和78.29 cm。多重比较结果(表5)表明，同时含有Rht-B1b和Rht-D1b矮秆基因小麦材料的平均株高最低，但与单独含有Rht-D1b矮秆基因小麦材料的平均株高无显著差异，而与单独含有Rht-B1b矮秆基因和不含所检测矮秆基因小麦材料的平均株高差异显著，矮秆基因的分布及株高数据详见表6。

表5 不同矮秆基因对91份春小麦育种材料株高的影响Table 5 Effect of different dwarfing genes on plant height of 91 Spring wheat breeding materials

表6 91份春小麦育种材料 Rht-B1b和 Rht-D1b的检测结果及株高Table 6 Plant height and detection result of Rht-B1b and Rht-D1b in 91 Spring wheat breeding materials

(续表6 Continued table 6)

(续表6 Continued table 6)

3 讨 论

本试验利用Ellis等[13]发表的4对特异性分子标记，其准确性已经过杨松杰等[15]、慕美财等[17]和唐 娜等[18]的验证，该标记多态性强且目的基因条带清晰，可应用于小麦分子标记辅助育种试验。小麦矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b为隐性基因，不宜于早代筛选, 但若利用分子标记辅助选择可提前获得含有矮秆基因的小麦个体，加快小麦矮化育种进程。本研究检测的321份材料中，Rht-B1b矮秆基因的分布频率高于Rht-D1b矮秆基因，这与梁 丹等[19]对263份CIMMYT材料的矮秆基因分子检测结果一致。

本试验对91份春小麦育种材料的株高进行相关分析，发现含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1b+Rht-D1b以及不含所检测矮秆基因小麦材料的平均株高分别为71.95、67.84、67.19和 78.29 cm，其中，单独含有Rht-B1b、Rht-D1b矮秆基因小麦材料的平均株高与Miralles等[9]和Brner等[7]的研究结果基本一致；但在本研究中，虽然同时含有Rht-B1b和Rht-D1b矮秆基因小麦材料的平均株高最低，但可能由于本研究试验材料品种数量的局限性，Rht-B1b和Rht-D1b矮秆基因同时存在时，降秆效应没有达到60%，与前人[9-10]研究结果不一致，所以，后期还需要加大样本量来验证这一结果。

多重比较分析发现，同时含有Rht-B1b和Rht-D1b矮秆基因小麦材料的平均株高最低，这些小麦材料共有26份，分别为07-7165、青春556、05cm178、05cm220、07-5866、08冬中788、08冬中3008、交原356、05-1173、格兰尼、08冬中1146、05-1411、07-6228、08冬中5378、兰杂7002、08冬中1807、轮选、临优一号、08-1312 、08冬中6741、07-6239、张掖1号、08-1826、08-3348、08-1699、08冬中2455。以上材料可在降低株高的抗倒伏育种中作为亲本使用。